s******y
发帖数: 28562 | 1 不妨查查BSA 或者 insulin 的序列吧？
实是 |
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H****s
发帖数: 301 | 2 (1). Coat your 96 well plate with NeutrAvidin or streptavidin, 1ug/well,
100ul/well. Let sit O/N in the fridge or 1 hour in the 37 degree incubator.
(2). Biotinylate your whole cell protein using Pierce EZ-link biotinylation
kit.
(3). After coating the plate with NeutrAvidin or streptavidin, wash once
with 1XPBS (200ul/well). Block with blocking solution (1%BSA, 1% milk, 200ul
/well). Room temperature, 30 minutes to 1 hour. After blocking step, dump
all blocking solutions.
(4). Then add your bio... 阅读全帖 |
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d****i
发帖数: 2346 | 3 1. 用milk还是BSA？要reuse的话哪个配一抗比较好？
2. 4C还是-20C？
做WB用。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 5 我是用bsa配的，直接－20，我半年前寸的抗体也能用。。。lol |
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B*****e
发帖数: 1005 | 6 只放在PBST中，没有BSA和milk，-20中，可用很久。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 7 非常感谢各位！
现在明确了：用BSA配在-20C最长可以放半年(根据 ntgxw 的经验)。
hellozero 说反复冻融肯定会降低抗体的效价。
问题：1. -20C保存的抗体反复冻融几次还可以用？
2. 有没有人用milk配制后方-20C冻存的？
我们实验室是用milk配制的抗体放4C一般一个月内还可以用。
我发帖子的目的是想尽可能充分利用一抗，当然不可能为了这个专门反复冻融去摸索，
也没必要，只是想看大家的经验。
再次谢谢各位！ |
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d****i
发帖数: 2346 | 8
一抗没有BSA/MILK孵育膜不太好吧，虽然前面有封闭，背景会高吗？ |
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d****7
发帖数: 109 | 10 我用过salmon sperm DNA block dynabead，没有任何效果，至少in my case，没有任
何效果，BSA block足以
IgG信号强莫非是Buffer contamination?我以前也出现过IgG信号强，然后重新prepare
所有buffer,就好了
block
invitrogen |
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s********n
发帖数: 248 | 11 我用过cell signaling 的pAKT T308,这个克隆是最好的
http://www.cellsignal.com/products/2965.html
block 用5%milk/PBST (0.02% TWEEN 20), dilute primary antibody in either 5%
milk or 5%BSA/PBST, 4 degree overnight.
quick wash 2/3 times, then wash 3 times*5 min with PBST,
dilute 2nd antibody (JACKSON LAB HRP-GOAT anti-Rabbit light chain) 1:2500 in 5%MILK/PBST
(如果杂带多，需要把二抗稀释在5%milk里), RT for 1h; 如果杂带不多，可以稀释1:
15000 in PBST, RT for 45min。
quick wash 2/3 times, then wash 5 times*5 min with PBST. |
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j****x
发帖数: 1704 | 12 一般公司都可以提供rational antigen design的服务，从序列中特征性选取多肽片段
然后交联到BSA等载体蛋白上再制备单抗或多抗。如果目标蛋白是有三级结构信息的，
这种表位预测+多肽免疫的成功率很高，一般在70%-80%以上。即便没有高级结构信息，
有经验的设计分析人员也可以将成功率控制在50%左右，一般而言选取2-3条多肽序列就
能至少有一个能制备出不错的抗体。我们这里有core facility专门提供这种服务，这
个技术本身应该说很成熟了。
自己原核表达纯化蛋白的部分片段自然也是一个选择，以前大部分人都不纯化而只是切
胶直接免疫，取决于你要做什么样的staining了，要求抗体特异性好的，就不建议这么
做了，光做western的话还凑合。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 13 如题，Qrt-PCR 显示细胞经某种处理后βIG-H3 mRNA有30多倍的增加，于是买回来这个
公司的抗体，按照说明书用5%BSA 按照1:1000稀释，过夜孵育后检测一点信号都没有，
即使用了很强的detecting reagents都没有。有没有正好用这个抗体的筒子，介绍点经
验吧？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 15 啊？那确实很有可能是有酶活性了。
要排除外来酶的影响，还有一个办法，就是放进一些其他蛋白（比方说BSA）
如果这些放进去的蛋白丝毫不受影响，但就是你的那个蛋白被切的话，那非常
有可能真的是自切酶了。 |
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f********n
发帖数: 6465 | 16 发信人: squirrabbit (松鼠兔), 信区: Biology
标 题: 也问问bradford法测量蛋白浓度
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Oct 26 06:14:12 2011, 美东)
是每次都要做标准曲线吗？那也太麻烦了吧
我们实验室的做法：167ul的BioRad的bradford溶液 加833ul水，混好加1ul稀释的样品
，用空白的样品调零，595nm测得的读数，每0.06算1ug／ul。读数最好不低于0.1，不
高于0.6, 高了就稀释样品。
这个误差是不是很大啊？一直对这个protocol不放心，不过大家都是这么测的。
发信人: squirrabbit (松鼠兔), 信区: Biology
标 题: Re: 也问问bradford法测量蛋白浓度
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Oct 26 06:36:57 2011, 美东)
那做一次标准曲线是不是可以一直用啊？
我看biorad的instruction manual给出了bsa和IgG的标准曲线啊 |
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s*********t
发帖数: 600 | 17 那做一次标准曲线是不是可以一直用啊？
我看biorad的instruction manual给出了bsa和IgG的标准曲线啊
你介绍介绍在非英语国家转行的经验啊，我也不想干生物了，累得要死还没钱没成就感，实验老是失败。
鸥鸟师兄挺能耐得住的，一把年纪了，坚持了那么多年，我佩服他。 |
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z********i
发帖数: 610 | 18 最近用Anti-acetyl-Lysine做WB，发现背景很高，膜上总是有一些小黑点，怀疑是
blocking的问题。用BSA blocking会好一些吗？不知道版上有没有人用这个抗体,wb的
条件是什么？
谢了。
antibody: millipore and Cell signaling Mouse mAb
blocking: 5% milk
time: 1hr
washing time after 2nd antibody: 1hr |
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z********i
发帖数: 610 | 19 I did not try BSA.
But my primary antibody is in 5% milk. Unfortunately it did not help.
Thanks
put
the |
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e*******r
发帖数: 275 | 20 解剖打散之后出来的都是各种细胞的混合物吧, 怎么分离和处理才能拿到纯的神经元或
者纯的胶质细胞呢? 加arac是抑制astrocyte分裂的,不能杀死它们吧. 加不加BSA会不
会有不一样? |
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h*****G
发帖数: 113 | 21 谢谢大家的回复和帮助。
1。关于NaN3,我看了资料，说是可以抑制细胞的代谢，这样可以减少细胞死亡以及cell
surface marker的endocytosis. 那NaN3具体的作用是什么，以及什么时候已经使用呢？
2。关于5%的FCS. 有些地方是用0.2%的 BSA. 这两个有什么去区别吗？ 谢谢。 |
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r*********y
发帖数: 124 | 22 试过几个FK2 anti-ub的抗体，背景都挺高（用2%BSA blocking）, 如果洗太久，信号
又太弱，请问谁有什么建议。谢谢 |
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a******c
发帖数: 597 | 23 如果IP后bands很多，可能是lysate的微小的不溶性pellet沉淀的原因，同时也和
antibody特异性有关。可以这样改进，细胞lysate IP前，超高速离心15分钟，上清用
protein A beads preclear。在lysate里加一抗binding不要超过一小时。加protein A
beads前，先用5% BSA 将beads 在4度block一小时。 |
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c*********8
发帖数: 369 | 24 有个染色的问题向各位专家请教，最近做Golgi 抗体染色，不知道怎么回事， 在显微
镜下看细胞基本上全绿，感觉核也是绿的，很难看到golgin 的部位，我用的first
antibody is golgin-97(human),mouse IgG1, monoclonal CDF4 (anti-Golgi) –
UNCONJ, the second antibody is Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L
)，在加一抗前，也用2%BSA和10% goat serum block 1hour, 在加二抗前也是充分冲洗
，不知到怎么会事，想问问大家有没有什么有效的protocol分享以下，非常感谢，我的
邮箱：c*********[email protected] |
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a*****2
发帖数: 175 | 25 We use GM130 antibody from BD Bioscience that works very well even in
chicken cells. Also I only use 3%BSA for blocking. Paraffin section doesn't
work for Golgi neither based on my experience.
+L |
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h*******o
发帖数: 4884 | 26 1) try other blocking solution and block longer
try BSA, non-fat milk, or both and block at least for 1 hour
2) Reduce your 2nd antibody concentration.
3) For primary antibody incubation, incubate in blocking buffer and try
either 1-2 hr at RT or 4oc overnight, whichever one you haven't tried yet |
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i***0
发帖数: 160 | 27 Thank you very much! Currently I am using 5% milk and 10^4 times of dilution
for secondary antibody.But I will try BSA next time. I have tried primary 1
hr at RT and O/N, and it seems better with primary 1 hr. I just hate
trouble shooting. |
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I*****y
发帖数: 6402 | 28 这个不行，你block membrane的时候，上面沾了很多milk or bsa proteins，背景太多了 |
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E*****1
发帖数: 610 | 29 Thanks for all of you.It really gave me some hints.
I was just thinking if i did not put sodium azide, The 1st antibody in BSA
is easy to go bad. I want to keep for while to use it (one or two or three
month). so I did that
Also my previous lab all did the same. Never happened this problem before.
Thanks again. You all are really nice |
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E*****1
发帖数: 610 | 30 Try new BSA without any sodium azmide, still not work!! |
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s******y
发帖数: 28562 | 31 如果你要认真做的话，应该这么做：
用anti-GFP 来pulldown GFP-actin, 或者直接在细菌里表达GFP (or GFP-actin, 没有
活性没关系，反正是用来western), 或者直接到公司买点GFP standard protein
sample.
然后先跑胶用蓝染或者银染，对照已知浓度的BSA 来测定浓度，然后用这个GFP (or
GFP-actin)来作为标准浓度来对比你的细胞里面的GFP-actin来估算浓度。 |
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H****n
发帖数: 26 | 32 自己折腾了好久，还是解决不了问题，只好来版上请教大牛了。
DNA shearing to 150-700 bp, Input DNA 量是～100ug，抗体用Abcam的anti-HA （
ChIP grade， 5ug for each IP）
抗体结合的buffer 配方是（ChIP dilution buffer： 20mMTrisHC PH8.0， EDTA PH8.
0 2mM, NaCl 150mM, SDS 0.01%, TritonX-100 1%）. 抗体incubate Overnight,
millipore的beads用dilution buffer 洗三遍，然后BSA block overnight 第二天加进
去，3-4hours.
还有，做的是tissue的ChIP（表达这个TF的细胞只占细胞总数的8%-10%），为了让固定
的1%甲醛渗透更快点，用tripsin消化了
组织（之前直接用SDS裂解组织也做过，效果也不好），固定10min.
wash： 1 low salt ->1 high salt->1 LiCL suffer->2* TE
问题: 1.... 阅读全帖 |
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l********s
发帖数: 70 | 33 我们可以讨论，这两天在做CHIP，你买 Cell singalling 的beads，我觉得挺好用。里
面把bsa什么的都是ready to use
另外我建议，用1mm glass beads 在计入125mM glycine 以后，打晕组织再次，打个6
次，中间休息1-2min 放在冰上。 trypsine 可以不用。 我这里些个protocol 可以给
你，07年nature protocol 有个 fast chip 你就可以借鉴
qq 53671616 |
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I*****y
发帖数: 6402 | 34 二抗也用BSA，奶粉里可能有phosphatase |
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t******k
发帖数: 5617 | 35 可以加牛奶。一抗如果是单抗一般使用BSA，多抗一般用脱脂牛奶，二抗统一用脱脂牛
奶。 |
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w********r
发帖数: 1431 | 36 一抗有时是没办法，用Fab和IgG free bsa block硬着头皮用。二抗理论上应该也可以
用，但尽量避免吧，何必找这个麻烦。 |
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c*********r
发帖数: 181 | 37 我用别的引物发现能P出来，现在的问题是为什么这个特异的引物对做不出来？好几篇
文献都用这个P出来了。加BSA，ACETAMIDE，各种方法我都试过了。 |
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n**********7
发帖数: 29 | 38 大家好。
我最近在用flow检测一种膜蛋白的表达。对于这种蛋白，现有的用于flow的抗体都是
recognize c－terminal的，所以只能做intracellular flow。我的基本步骤是分离细
胞后，加Fc block，fix，permeablize，0.5% BSA block buffer,然后分别染一抗和二
抗，只有single color。
现在遇到的问题是，这种蛋白在treatment之前，不仅在细胞表面有表达，也存在于
intracellular vesicles里，所以不知道permeablize之后会不会检测到的量不仅仅是
表面的表达量。具体应该怎么做才能够保证我仅仅检测到cell surface的量呢？或者除
了flow之外还有其他的方法更适合解决这个问题？
多谢了！
做这个实验有两个多月了，反复试结果都不好，真着急！！ |
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S******9
发帖数: 2837 | 39 脑子如果灌注以后很容易没有背景的
10天的老鼠可以，直接左心室灌注，用30G的针头
现在可以试一下blocking buffer： 5%BSA+5%FBS+0.3%Triton 100 |
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B*N
发帖数: 455 | 40 可能是蛋白太浓了，把样品稀释一下。同时用你的lysis buffer溶解一点BSA，加上同
样的SDS sampling buffer变性，跑一个胶做commasie blue染色，如果marker也是这样
那就是你的溶液配错了 |
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i***0
发帖数: 160 | 41 To be honest, according to my experiences, the worst reliability of a plate
reader is the absorption assays. I have tried Bradford or OD280, both give
high standard deviation. However, if you just want a guess, try using your
sample at original conc, 1:1 dilution, and 1:4 dilution in triplicate. You'd
better have BSA standards at least 5 concentrations in the same plate in
triplicate. These will give you a relatively reliable readout. OD is linear
at 0.5 to 1, roughly. good luck |
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S*********s
发帖数: 304 | 43 这些天然产物target很多蛋白。写paper的时候说target NF-KB比较好发paper。
你说它也target BSA可能就没杂志收你的paper了。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 44 odyssey don't use milk or BSA.
It have its own buffer from fish protein. |
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e**e
发帖数: 166 | 45 我的蛋白是高尔基体上膜蛋白复合体。大概４００－５００Dka。
我用NP４０ 溶解后，用６０％的（NH４）２SO４沉淀可以得到６０％的活性。 现在
过分子筛柱。
我有个（LKB Triacryl GF２００）的柱子 （１。６ x ６０cm） （１２０，０００－
１５，０００，０００）。 我用Hepes buffer （１ml／min的流速。 我在用Blue
Dextran （MW ２，０００，０００）和BSA 的时候， 发现他们同时一起出来了。
这个柱子可以分离吗？ 还有别的建议吗？ |
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e****s
发帖数: 1125 | 46 不是完全看懂了。
你应该是问分子筛能不能用来分离你这个大的Complex,是从cell lysate还是纯蛋白
reconstructed的complex?
如果是salt cut 后的样品直接上gel filtration, 应该是不行的。 分子筛通常也极少
用于第一步的初提。
如果是pure protein重构的复合物，那就看单体的大小了。明显BSA左右的蛋白 （~
60kd?）是分不开的，都在死体积里出来了。 |
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n**********u
发帖数: 77 | 47 qpcr的eff%太低了，around50%, BSA的final conc是0.8micro gram/micro liter, 是
网上推荐的最大的值了，还有什么原因呢？ 标准曲线最大浓度的一组ct值是4，这个是
不是不太正常？但是sample的ct值都是十几左右，浓度都很大。 |
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t**l
发帖数: 109 | 48 你的1st and 2nd antibody 还有样品是什么种的，血清中可能会有IgG吧，2nd
antibody应该是那种light chain specific
50KDA的位置正好是IgG heavy chain 的位置。
还有就是rabbit的antibody要比goat的好用。goat很脏，普通的BSA和MILK根本block不
了。 |
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n**********u
发帖数: 77 | 49 我最近用promega的Gotaq酶做pcr，然后再TA克隆。 情况是这样的：我循环是40,后面
有10min 72度extension.但是就是连接不上，pcr product跑胶后的条带是很亮的。 我
怀疑是我的TA kit的问题，但是也不是，因为我把我的pcr products 中浓度较弱的几
个当作template再来一次short-pcr后（15cycles,然后10min 72度extension）得到的
产物回收再做TA克隆，得到满板。这说明我的TA克隆是正确的，就是pcr的问题。 我怀
疑是开始的循环数太多了，就降到35个循环，但是还是不行。 后来我又怀疑是我的酶
和体系出问题了，pcr的产物可能没有加上A尾，我加大酶量和dntp的量。 但是还是不
行。我后来又做了加A尾的实验，换了fermentas一般taq酶，也还是不行。大家说可能
是什么原因。
我的pcr体系：
20ul体系
H2O 9
5*GoTaq color buffer 4
dNTP（2mM） 2
mgcl2（25mM） 1.6
BSA（100mg/ml） 0.15
... 阅读全帖 |
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x********e
发帖数: 35261 | 50 一直用promega的gotaq做TA, 跟你不同的是我不加氯化镁和BSA,最多34个cycle。跑胶
确定条带单一后我直接用1ul PCR产物做连接
会不会你盐浓度太高了,或者产物和质粒的比例不对 |
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