s*****t
发帖数: 107 | 1 小弟最近刚开始做CoIP-Mass spectrum。请问版上没有大虾有好的protocol
我的实验是这样的在293细胞里面转染Flag的目的蛋白，然后pulldown flag
然后跑SDS-PAGE胶，但是出了很多band，请问有没有好的办法除去非特异的band。
多谢~ 5个包子 |
s*****t
发帖数: 107 | 2 小弟最近刚开始做CoIP-Mass spectrum。请问版上没有大虾有好的protocol
我的实验是这样的在293细胞里面转染Flag的目的蛋白，然后pulldown flag
然后跑SDS-PAGE胶，但是出了很多band，请问有没有好的办法除去非特异的band。
多谢~ 5个包子 |
a******c
发帖数: 597 | 3 如果IP后bands很多，可能是lysate的微小的不溶性pellet沉淀的原因，同时也和
antibody特异性有关。可以这样改进，细胞lysate IP前，超高速离心15分钟，上清用
protein A beads preclear。在lysate里加一抗binding不要超过一小时。加protein A
beads前，先用5% BSA 将beads 在4度block一小时。 |
s*****t
发帖数: 107 | 4 非常感谢～你的建议很有用～
请问在pull down完了以后你洗beads的时候有没有什么strigent的办法多洗掉一些band？ |
s*********t
发帖数: 600 | 5 350mM/甚至420/500 NaCl
0.1% NP-40
洗5遍
band？
【在 s*****t 的大作中提到】
: 非常感谢～你的建议很有用～
: 请问在pull down完了以后你洗beads的时候有没有什么strigent的办法多洗掉一些band？
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g*********5
发帖数: 2533 | 6 您能不能给给各完整的protocol？谢谢。
【在 s*********t 的大作中提到】
: 350mM/甚至420/500 NaCl
: 0.1% NP-40
: 洗5遍
:
: band？
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g*********5
发帖数: 2533 | 7 我用的是sigma的flag resin，用flag peptide 洗脱的。
不过得到很多蛋白，后续IP没有验证出来...
band？
【在 s*****t 的大作中提到】
: 非常感谢～你的建议很有用～
: 请问在pull down完了以后你洗beads的时候有没有什么strigent的办法多洗掉一些band？
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s*********t
发帖数: 600 | 8 protocol一搜一大把呀 找篇大文章method部分 自己修改下就能用
M2 resin有几个常见的contamination
最好有个control对照一下
用agrose beads preclear一下也行 不过不是必须的
盐浓度和detergent也比较重要
【在 g*********5 的大作中提到】
: 您能不能给给各完整的protocol？谢谢。
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a******c
发帖数: 597 | 9 我一直觉得，用更strigent的washing的办法，其实远不如在binding上下功夫摸索更好
的IP条件。我遇到过的一个真实例子是，我已经用含有SDS的RIPA buffer作为细胞裂解
和washing beads的buffer了，control IP那里仍有signal。最后采用缩短Antibody
binding的时间的办法，最后解决了这个问题。 |
g*********5
发帖数: 2533 | 10 据Invitrogen网站上的介绍，一些短暂结合的蛋白应该binding小于4个小时，甚至1.5
小时... |
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l****y
发帖数: 398 | 11 the best way is metabolic isotopic labeling, then quantitative mass spec.
【在 s*****t 的大作中提到】
: 小弟最近刚开始做CoIP-Mass spectrum。请问版上没有大虾有好的protocol
: 我的实验是这样的在293细胞里面转染Flag的目的蛋白，然后pulldown flag
: 然后跑SDS-PAGE胶，但是出了很多band，请问有没有好的办法除去非特异的band。
: 多谢~ 5个包子
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F*K
发帖数: 608 | 12 how do you guys like tandem affinity purification?
【在 l****y 的大作中提到】
: the best way is metabolic isotopic labeling, then quantitative mass spec.
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K******S
发帖数: 10109 | 13 you still get some non specific bindings and you need a lot more starting
materials.
【在 F*K 的大作中提到】
: how do you guys like tandem affinity purification?
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p********i
发帖数: 116 | 14 再加个HAtag，把IP下来的东西再IP一次。 |
b*****u
发帖数: 75 | 15 Can you list any "M2 resin有几个常见的contamination"? Thanks a lot! |
s*********t
发帖数: 600 | 16 如果是nuclear extract 的话，好像有PRMT5， 还有某HDAC。当然如果看到HSP70/80之
类，不过HSP不是M2特有的咯
【在 b*****u 的大作中提到】
: Can you list any "M2 resin有几个常见的contamination"? Thanks a lot!
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t*****P
发帖数: 36 | |
C******2
发帖数: 97 | 18 1,加个HA试试。
2，可以考虑用GLYCIN洗脱，感觉比3*FLAG好，特别是如果你已经用了3*FLAG构建了表
达载体。也可考虑用ARGININE洗脱。
搭车问个问题，有人做过非人类细胞的MS吗？具体的难点在哪里，DATABASE的不足？
【在 s*****t 的大作中提到】
: 小弟最近刚开始做CoIP-Mass spectrum。请问版上没有大虾有好的protocol
: 我的实验是这样的在293细胞里面转染Flag的目的蛋白，然后pulldown flag
: 然后跑SDS-PAGE胶，但是出了很多band，请问有没有好的办法除去非特异的band。
: 多谢~ 5个包子
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F*K
发帖数: 608 | 19 不太清楚，老鼠细胞也会有问题吗？
【在 C******2 的大作中提到】
: 1,加个HA试试。
: 2，可以考虑用GLYCIN洗脱，感觉比3*FLAG好，特别是如果你已经用了3*FLAG构建了表
: 达载体。也可考虑用ARGININE洗脱。
: 搭车问个问题，有人做过非人类细胞的MS吗？具体的难点在哪里，DATABASE的不足？
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l**********1
发帖数: 5204 | 20 是呀 大猩猩 Chimp (Pan troglodytes) 的ES 细胞会有问题吗?
//genome.ucsc.edu/Neandertal/
//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway
【在 F*K 的大作中提到】
: 不太清楚，老鼠细胞也会有问题吗？
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