w******e
发帖数: 1187 | 1 土人第一次做，全盘follow trizol的protocol。为省reagent用了100mg tissue
per ml trizol。发现以下问题，请达人指点：
1. chloroform extraction后的precipitation，为什么用isopropanol？室温
incubate也让我很困惑。。。
2. 做了两次，第一次是heart，拿到RNA很顺利，测OD时发现：260 peak偏向270；
230附近有极高的峰。看来chloroform和precipitate后wash的步骤都不太effective？
3. 第二次做liver，搞到巨多RNA，很oily，dry了之后pellet死活不溶，试了
60oC加热，加大volume，最后还是有很多不溶。是不是trizol用少了？
4. 用了hand held homogenizer和pestle+mortar两种tissue homogenization
methods，run了urea agarose gel（顺便请问大家都用什么denaturing gel），
18S:28S rRNA大约1：1，很困惑degra |
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h*******o
发帖数: 4884 | 2 standard normalized, 是指都normalized 到 control gene，i.e. b-actin 或
者18s RNA之类的吗？
谢谢
我pearson correlation和Euclidean都试过了
sample之间的cluster确实基本一样，个别的位置换了一下
但是不同gene之间的cluster就很多不一样 |
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w******e
发帖数: 1187 | 3 28s:18s should be 2:1 I believe? |
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s****z
发帖数: 50 | 4 准备用real-time PCR 检侧一个RNA在细胞核和细胞质中的分布。
请教板上的大虾，用什么做internal control 比较合适啊？
似乎18S, tubulin, etc, 都不好 |
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m******5
发帖数: 1383 | 5 我在普通 Agar胶上跑带型很不好看
而且下面有大量smear
但在agilent的nano chip上跑得到的结果死quality极好，28,18s信号很sharp |
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h******u
发帖数: 131 | 8 一种柱子，从公司买的。如果你的基因有homologue, 或者多个isoform. 也有可能出现
这种情况。 |
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n*****e
发帖数: 119 | 9 可以用kit把大部分rRNA去除。看看能不能增强信号。 |
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w***z
发帖数: 1158 | 11 也碰到过这个问题。
用质粒做模板标记探针，针对同一基因做了2条探针，其中一条探针blot后只有特异条
带，但另一条除了特异条带外，18 28S也都有。总RNA和mRNA都试过，结果相似。 |
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d******u
发帖数: 178 | 12 这个如果是直接用PCR产物标记作探针挺常见。我们是把扩增片段克隆到pGEM-T里面，
用酶切产物作探针，基本解决问题。 |
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d******u
发帖数: 178 | 13 质粒酶切后a-P32 CTP+Klenow标记 |
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c******y
发帖数: 148 | 14 模板是cDNA，
1，cDNA合成之前是否用Dnase I 消化
2，RNA降解途径或者RNA processing过程中会出现polyA加尾现象，我了解的至少植物
叶绿体的RNA的存在这种现象，刚google下，似乎哺乳动物也存在这种异常的加尾，用
oligodT反转录有可能会产生rRNA的cDNA
3 质粒做模板
miniprep的时候是否有痕量的大肠杆菌的基因组污染？
建议放弃PCR做模板，
酶切质粒，或者合成oligo探针
1，2，3的解释也仅仅是个人猜测了 |
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k****o
发帖数: 589 | 16 以前还没遇到这种情况。用Pfaffl法做的10倍梯度稀释标准曲线。样品是用trizol提取
的RNA逆转录
而成的cDNA,RNA的260/280 ratio大于1.9。PCR跑出来melting curve形状良好。
negative
control一切正常。
一个基因是18S，用IDT在线程序做的primer。效率75％，标准曲线R^2>0.99，Ct范围20
～35。
另一个目标基因，同样方法设计primer。效率200％，标准曲线R^2>0.98,Ct范围20～35。
试过踢走标准曲线中的某些数据点，不解决问题。
不知道是不是机器出问题了？包子答谢。 |
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t*****z
发帖数: 1598 | 17 谢谢楼上各位，尤其是Chamgrape的方法，如果真的管用那太好了。我今天试了下一个
total RNA。一条亮带在0.8kb，一条暗带在1.4kb，乘以2之后勉强接近18S和28S的大小
了。粗略定量也许可以吧。 |
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c********b
发帖数: 363 | 18 normally people use rRNA (like 18S or 28S) as a control, so run on is
general for RNA polymerase but not only for Pol II.
Run-on reflects how many active polymerases were binding to the gene-of-
interest at the moment the cells were freezed. So it can reflect the
transcription activity (I did not stay that it can tell the stability). And
of course, you know nothing is 100% in biology, right?
nuclear run-on, just google it, easy to find. It is not good for short genes
, because less space for pol... 阅读全帖 |
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r******y
发帖数: 21907 | 19 我用18s一般还好，有的用ubq貌似不行特别是有可能下游有ubiquitination的。。。。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 21 try
Avatar in Sweden:
www.avatar.se/xref/wr/index
then its noted:
HUGO
The History of HUGO
The Human Genome Organisation
History, Purposes and Membership – Dr. Victor A. McKusick, 1989, Genomics
The Human Genome Organisation (HUGO) was conceived in late April 1988,
//www.genenames.org/
//www.hugo-international.org/ |
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m***o
发帖数: 272 | 22 十分感谢！文章有些难，需要数学背景，打算再用文章里的UBC和rps18检测。如果都和
actin有类似的降低，说明那个样品就是低。用18SRNA总是觉得量太高，无法真正
normalization。而且18s是rRNA。 |
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a******7
发帖数: 7936 | 23 18S, beta-tubulin, beta-actin |
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w***7
发帖数: 463 | 24 28s/18s should be greater 1.5. yours is 1. please redo it. your profesor is
going to kill you. |
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S*********s
发帖数: 304 | 25 多选几个内参
b2m
18sRNA
GAPDH
看看内参之间是否一致。
一般尽量保证input RNA量是一样的 |
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m***o
发帖数: 272 | 26 其实很多文献谈qPCR内参的。可以google一下。这里说一下我的体会。18sRNA 做内参
的一个确定是他不是mRNA,另外他的ct太小。但是有时他还是比较准确。比如我做不同
老鼠的脂肪组织就比较好。而且有片文献专门比较了脂肪组织不同的几个内参，发现
18RNA是最好的一个，而且 在dilute很多的cDNA里，发现变化也不是很大。
不过，我只是在找不到别的mRNA内参时用18sRNA.楼上说用GAPDH，actin，做内参，实
际GAPDH 不是个好的内参，很多时候会变化。我推荐用rpt18.不过再做自己样品时，是
要比较一下不同的内参的。搜搜版上，这个问题好像讨论过。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 27 谢谢你详细的意见，我最近几次的PCR中也发现，
18sRNA CT值只有8点多，但是确实很稳定，不同处理之间的变异几乎可以忽略。 |
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H********9
发帖数: 525 | 28 以前从没提过Fungi的DNA，查了一些文献，似乎没啥快速简洁的方法呀
主要是要鉴定18s，可是不象细菌那么简单，取菌落加水煮沸后就可以做PCR的模板，所
以只好先提DNA了
不知班上有没有大侠提过fungi的DNA，有好的，简洁的方法没？
谢谢 |
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W*****o
发帖数: 1780 | 29 现在检查mRNA integrity的办法是不是都是通过rRNA的？（28S:18S或者RIN).有没有办
法不通过rRNA直接检测mRNA是否降解的办法？谢谢！ |
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W*****o
发帖数: 1780 | 30 能有个定量的概念吗？就像RIN或者28S:18S这样的数值。
而且对于RT-PCR是针对特定基因的。不同基因可能结果不同。 |
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a*******g
发帖数: 33 | 31 大家好，我在做老鼠关节炎模型，需要提取RNA,但是不理想。有没人做过这个可以分析
下经验的？谢谢我先把踝关节剪下 （长1cm左右），然后液氮冷冻，放－80保存。裂解
是用Roche的Megbead，RNA提取是按照Qiagen的纤维组织RNA提取Kit。没有做DNase消化
。用Agilent2100检测，很多样品只有很粗的一条带，在18s band附近，估计是genomic
DNA? |
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l**********t
发帖数: 138 | 32 同样的cDNA检测gapdh时Ct值在16左右，18s在12左右，我觉得蛋白表达应该不会很强 |
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l******g
发帖数: 1145 | 34 我现在在做些ex vivo的实验，就是把mouse的主动脉分离出来后，放在培养基里养三天
，同时加药。三天后收集样品提rna,然后profiling下各基因的表达，看是否和in
vitro的结果一致。
如果分离主动脉后立刻提rna,结果一直很好。但现在ex vivo养了几天后，碰到了些问
题。
1,培养几天后，能提出来的rna量急剧减少，感觉养几天后组织不是很健康的原因。少
归少，但还是够做rt之类的后续。
2,我通常用18S和gapdh做realtime pcr的内参。但郁闷的是，在加药处理的样品里，这
两个基因的表达也呼呼的往上升，甚至比要检测的其他基因升得都要高。以至于
normalize后，根本看不到变化，甚至是相反的变化。ps，在做rt的时候，每个样品我
都加了相同量的rna，按经验来说，内参应该非常接近，曲线几乎都重合在一起才对。
现求问怎么破？
我感觉技术上没什么问题，最简单的就是换一个比较stable的内参（尤其是心血管系统
内的）。
求有经验的推荐！一经验证work的话，双黄包奉上！ |
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I*******U
发帖数: 869 | 35 最近要提取从白色脂肪里面提取SVF，根据protocol我确实看到了pellet，用TRI-
reagent也提取到了mRNA,nanodrop测出的浓度有800ng/ul，但是我试了cyclophilin，
gapdh，18s几个内参，都测不到CT值。已经重复几次了，郁闷的不行。请教各位，有什
么建议么？
SVF protocol
1）isolate WAT,
2) Incubate tissue @ 37C for 45min with shaking @ 80 rpm （Collagenase I，
1mg/ml）
3）300g for 10min
4) Dissolve pellet in Tri-reagent. |
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I*******U
发帖数: 869 | 36 现在不是组织解离不够，我能拿到细胞，也能测到RNA 浓度，可是housekeeping gene
18s，GAPDH和Cyclophilin都测不出，这个是什么原因？
楼上的你有没有测过SVF的gene表达呢？用什么housekeeping gene呢？谢谢
ml |
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k*****n
发帖数: 417 | 37 试了两个同位素标记的DNA短探针 都只有50 base左右 杂交温度42度 但结果是一个检
测到28S 一个检测到28S和18S 都没有看到目的基因 请问这是怎么回事？可以通过提高
杂交温度减少非特异结合吗？
非常感谢~~ |
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z*******n
发帖数: 1034 | 38 http://gamerboom.com/archives/84371
每日观察：关注亚马逊Fire智能手机等消息（6.19）
发布时间：2014-06-19 11:10:09 Tags：Fire智能手机,Josef Fares,Windows Phone,
儿童用户盈利
1）Juniper Research最新报告预测，2014年手机游戏总收益预计达209亿美元，到2016
年则将增长38%，突破289亿美元，但手机和平板电脑游戏收益仍然不足以全面超越专用
游戏设备上的游戏收益。
今年初的一份报告显示，手机和网络游戏收益在2017年将达600亿美元，而整个游戏行
业收益则将超越1000亿美元。
tablet-gaming(from intomobile)
2）据gamasutra报道，亚马逊日前宣布推出自产智能手机Fire，该设备采用亚马逊基于
Android的Fire操作系统，并直接与亚马逊应用商店绑定。
亚马逊创始人及首席执行官Jeff Bezos透露，该设备将于6月25日在AT&T独家发售，采
用了4.7英寸的LCD屏幕，运行2.2Ghz的CPU，2GB的RAM，如果用户购买2... 阅读全帖 |
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O*****n
发帖数: 78 | 39 OK，我的硬件是X820，Banggood上买的6GB/64GB版本。随机来的是一个有Google套件的
ROM。XM + FP不能用，具体情况我以前的帖子说了：
http://www.mitbbs.com/article_t/CellularPlan/87039.html
前几天试过用Lineage OS 14.1版本，也不行，而且更糟糕，连XM的data都不能用。
今天试了刷India版本的ROM（X821）。基本上是一样的，也不行。
然后就刷了中国版（X820）的S26。一直没去试是因为这些版本里面的junk太多，而且
没有Google套件。Anyway，刷好以后就看到有些不同的地方，比如Settings --> About
Phone 里面报告的status就包括MIN, PRL version信息。然后在Dual SIM & mobile
networks里面折腾了一圈，OK了。刚刚看到marychung的信息，看来18S的版本也可以。
Voice能用，但是Google Voice还是不能用，估计少了些Google的东西。 |
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K****o
发帖数: 2183 | 40 额。。据我所知，EB 3.5 v6和6.2 v8基本上加速差不多，5.0是要慢一些，但也差不了
多少。。5.0油耗不是很清楚。我的油耗avg 19-20.（2WD）
快和慢都是相对的，我觉得你要是真想知道，最好的办法就是去亲自体验一下。。你确
定之前你租的那个是2011 5.0V8么，如果是2010款的，比5.0v8还要慢
ok,去网上翻了一下数据，
0-60
5.0v8: 7.18s
3.5v6: 6.79s |
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w*******y
发帖数: 60932 | 41 Amazon
Tachikara Institutional quality Composite VolleyBall:
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Official size and weight
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