c*****n
发帖数: 233 | 1 小弟还是上次那个问RT_PCR问题的那个，谢谢各位前辈的热心解答。我不是科班的生物
学生，最近刚开始学这些技术，如果问的问题太菜，大家见谅。
这次把我total RNA的结果贴上来，让大家看看rna的质量怎么样。关于purity, 260/
280>=1.7。然后浓度在600ug/ml左右。大家觉着我这个total rna能用来RT吗？
最近还是没有什么进展，我怀疑是reverse transcription有问题。大家有没有推荐的
酶？我目前用的new england biolab的kit.
图片里的marker也贴上了。 |
c*****n
发帖数: 233 | 2 total rna是用hela提的。第一列的sample是G0的细胞，第二列是用double thymidine
同步得到的mitosis的细胞。 |
w*********n
发帖数: 439 | 3 你的RNA提出来以后测浓度的时候应该稀释在TE里面,拿TE当空白对照,
RNA的260/280 应该在1.8-2.3之间。
我觉得你的RNA提的还是不错的，我一般用invitrogen的RTkit,非常好用。在RT之前一
定要用DNAase 处理你的RNA。（DNAase最好也用Invitrogen的）
【在 c*****n 的大作中提到】
: 小弟还是上次那个问RT_PCR问题的那个，谢谢各位前辈的热心解答。我不是科班的生物
: 学生，最近刚开始学这些技术，如果问的问题太菜，大家见谅。
: 这次把我total RNA的结果贴上来，让大家看看rna的质量怎么样。关于purity, 260/
: 280>=1.7。然后浓度在600ug/ml左右。大家觉着我这个total rna能用来RT吗？
: 最近还是没有什么进展，我怀疑是reverse transcription有问题。大家有没有推荐的
: 酶？我目前用的new england biolab的kit.
: 图片里的marker也贴上了。
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c******r
发帖数: 3778 | 4 把你的实验步骤详细贴上来
【在 c*****n 的大作中提到】
: 小弟还是上次那个问RT_PCR问题的那个，谢谢各位前辈的热心解答。我不是科班的生物
: 学生，最近刚开始学这些技术，如果问的问题太菜，大家见谅。
: 这次把我total RNA的结果贴上来，让大家看看rna的质量怎么样。关于purity, 260/
: 280>=1.7。然后浓度在600ug/ml左右。大家觉着我这个total rna能用来RT吗？
: 最近还是没有什么进展，我怀疑是reverse transcription有问题。大家有没有推荐的
: 酶？我目前用的new england biolab的kit.
: 图片里的marker也贴上了。
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c*****n
发帖数: 233 | 5 RT之前为什么一定要用dnase处理？我现在的问题不是有DNA污染，而是RT-PCR之后什么
产物都没看到。
【在 w*********n 的大作中提到】
: 你的RNA提出来以后测浓度的时候应该稀释在TE里面,拿TE当空白对照,
: RNA的260/280 应该在1.8-2.3之间。
: 我觉得你的RNA提的还是不错的，我一般用invitrogen的RTkit,非常好用。在RT之前一
: 定要用DNAase 处理你的RNA。（DNAase最好也用Invitrogen的）
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c******r
发帖数: 3778 | 6 光这么看不行。
你把从提RNA开始所有步骤详细贴一下
【在 c*****n 的大作中提到】
: RT之前为什么一定要用dnase处理？我现在的问题不是有DNA污染，而是RT-PCR之后什么
: 产物都没看到。
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n********k
发帖数: 2818 | 7 Did u read my last response? follow that one, if u cannot get it, come back
and let us know every single details and we/I will help you through this...
Again, as Clonebar asked again, for any young folks seeking help, the more
details one could provide, the more help one could receive...without details
, any suggestions would be a crap-shoot...
【在 c*****n 的大作中提到】
: 小弟还是上次那个问RT_PCR问题的那个，谢谢各位前辈的热心解答。我不是科班的生物
: 学生，最近刚开始学这些技术，如果问的问题太菜，大家见谅。
: 这次把我total RNA的结果贴上来，让大家看看rna的质量怎么样。关于purity, 260/
: 280>=1.7。然后浓度在600ug/ml左右。大家觉着我这个total rna能用来RT吗？
: 最近还是没有什么进展，我怀疑是reverse transcription有问题。大家有没有推荐的
: 酶？我目前用的new england biolab的kit.
: 图片里的marker也贴上了。
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c*****n
发帖数: 233 | 8 我只是想问一下，大家怎么看我提取的RNA的质量。 |
z**b
发帖数: 18 | 9 我前段时间也是没有产物，后来发现是酶的问题，向别的实验室借了一点酶知道的。有
时侯大公司也不能太相信。后来他们给我免费重新寄了一盒。
你这个DNA污染也是个问题。 |
l**********1
发帖数: 5204 | 10 Genomic DNA plus protein (some RNase + enzyme)
contaminated within your Total RNA extraction sample
from gel picture: the most near
414004.jpg
(160922 字节)
that shining line is Genomic DNA absolutely.
for good RNA extraction protocol
please go to
//tools.invitrogen.com/content/sfs/productnotes/F_Trizol%20and%20Trizol%20LS-041018-RD-TL-
HL0506021.pdf
【在 c*****n 的大作中提到】
: 我只是想问一下，大家怎么看我提取的RNA的质量。
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l**********1
发帖数: 5204 | 11 你简直是在提取genomic DNA 吧 啊?
50 kbp length 以上的Gel picture 白的亮眼球的 都是 Genomic DNA
氯仿or 意丙醇抽提的话 接近界面的 界面附近液层的 移液枪的chip 尖端 不得在碰到那个位置的时侯
有丝毫的吸液的大拇指的松动的动作
酒精沉淀 以及清洗的分离液体作业的时候 同样
好的RNA Extraction PP 如下:
[回复]
[ 5 ]
发信人: contain (containor), 信区: Biology
标 题: Re: 还是RT_PCR
发信站: BBS 未名空间站 (Thu May 24 22:06:11 2012, 美东)
RT之前为什么一定要用dnase处理？我现在的问题不是有DNA污染，而是RT-PCR之后什么
产物都没看到。
【在 w*********n 的大作中提到】
: 你的RNA提出来以后测浓度的时候应该稀释在TE里面,拿TE当空白对照,
: RNA的260/280 应该在1.8-2.3之间。
: 我觉得你的RNA提的还是不错的，我一般用invitrogen的RTkit,非常好用。在RT之前一
: 定要用DNAase 处理你的RNA。（DNAase最好也用Invitrogen的）
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a******8
发帖数: 56 | 12 RNA quality is low.
1. you have signal in the well, likely from protein.
2. besides 28s/18s RNA bands, you have higher mol weigh stuff in the gel
3. 28s/18s ratio should be above 2, while yours is almost equal, which
indicates substantial degradation
Get better RNA first. At least no protein should remain in your yield.
This will affect your RT reaction. |
n********k
发帖数: 2818 | 13 First of all, I could be wrong but I am not sure you are on the right track
trouble-shooting so far...
As some said, this RNA extraction is not that good...That said, for a
cloning work, this may not be a problem at all...different goals require
different quality...As for protein or organic solvent etc, it may not be
that good but it is presumably fine, not horrible I would say..with today's
enzymes(very powerful), it is likely not a problem either...it would be very
bad if you were try to determine the level of gene expression though...so
one has to look at an issue accordingly...
All that said, I personally don't think none of these is a problem here.
..However, to clone 5kb is not an easy task for a green hand...RT in itself
is challenging, one may want to choose some kits over the others; to PCR
5k again is not that easy either for certain enzyme, and green hands, one
would also need to consider the choice of the enzyme systems...etc etc...so
I am not surprised at all to see your failure...either you have to know all
these yourself and develop/find a good protocol or work with some
experienced person to get it...
as I said in my previous post, I would first choose to clone about 0.5-1kb
and make sure my systems could work...once that's done, then do 3-6 fragment
pcrs individual and in the end use 1/2 rounds of fusion PCR to get the 5kb
gene...it is doable as one piece, but by breaking down to several fragments,
the technical barrier is a magnitude lower for a green hand...Good luck....
【在 c*****n 的大作中提到】
: 小弟还是上次那个问RT_PCR问题的那个，谢谢各位前辈的热心解答。我不是科班的生物
: 学生，最近刚开始学这些技术，如果问的问题太菜，大家见谅。
: 这次把我total RNA的结果贴上来，让大家看看rna的质量怎么样。关于purity, 260/
: 280>=1.7。然后浓度在600ug/ml左右。大家觉着我这个total rna能用来RT吗？
: 最近还是没有什么进展，我怀疑是reverse transcription有问题。大家有没有推荐的
: 酶？我目前用的new england biolab的kit.
: 图片里的marker也贴上了。
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Z**********g
发帖数: 222 | 14 简单的说，有RNA降解，也有DNA/蛋白污染。 |
c*****n
发帖数: 233 | 15 为了降低DNA/蛋白污染，我可以在RT之前用DNAse和Proteinase处理吗？要是可以的话
，应该怎么做？ |
c*****n
发帖数: 233 | 16
track
s
very
I just want to use it for a cloning work.
here.
【在 n********k 的大作中提到】
: First of all, I could be wrong but I am not sure you are on the right track
: trouble-shooting so far...
: As some said, this RNA extraction is not that good...That said, for a
: cloning work, this may not be a problem at all...different goals require
: different quality...As for protein or organic solvent etc, it may not be
: that good but it is presumably fine, not horrible I would say..with today's
: enzymes(very powerful), it is likely not a problem either...it would be very
: bad if you were try to determine the level of gene expression though...so
: one has to look at an issue accordingly...
: All that said, I personally don't think none of these is a problem here.
|
c******r
发帖数: 3778 | 17 what's your purpose to RT-PCR 5kb?
if just to clone it, best to buy and clone from a plamid.
if to detect expression, best to do RT-PCR with smaller fragment.
if to look for mutations, best look in specific range.
if to check integrity, best to probe for northern.
...
Direct RT-PCR a 5kb fregment might not be an easy job for a beginner. You
might spend several months, even a year and end up nothing. Try to work
around the problem might be a better choice.
【在 c*****n 的大作中提到】
:
: track
: s
: very
: I just want to use it for a cloning work.
: here.
|
c*****n
发帖数: 233 | 18
网上没有看到卖我们这个clone的。应该可以花2k左右定制，但是老板穷，不会掏钱的。
【在 c******r 的大作中提到】
: what's your purpose to RT-PCR 5kb?
: if just to clone it, best to buy and clone from a plamid.
: if to detect expression, best to do RT-PCR with smaller fragment.
: if to look for mutations, best look in specific range.
: if to check integrity, best to probe for northern.
: ...
: Direct RT-PCR a 5kb fregment might not be an easy job for a beginner. You
: might spend several months, even a year and end up nothing. Try to work
: around the problem might be a better choice.
|
u**********d
发帖数: 573 | 19 re
既然是HeLa，材料肯定便宜啦，吸取上清的时候少吸血嘛，取1/2甚至更少都可以，RNA
浓度降低一些，但不会到一个数量级，绝对够用。
碰到那个位置的时侯
【在 l**********1 的大作中提到】
: 你简直是在提取genomic DNA 吧 啊?
: 50 kbp length 以上的Gel picture 白的亮眼球的 都是 Genomic DNA
: 氯仿or 意丙醇抽提的话 接近界面的 界面附近液层的 移液枪的chip 尖端 不得在碰到那个位置的时侯
: 有丝毫的吸液的大拇指的松动的动作
: 酒精沉淀 以及清洗的分离液体作业的时候 同样
: 好的RNA Extraction PP 如下:
: [回复]
: [ 5 ]
: 发信人: contain (containor), 信区: Biology
: 标 题: Re: 还是RT_PCR
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w***7
发帖数: 463 | 20 28s/18s should be greater 1.5. yours is 1. please redo it. your profesor is
going to kill you.
【在 c*****n 的大作中提到】
: 小弟还是上次那个问RT_PCR问题的那个，谢谢各位前辈的热心解答。我不是科班的生物
: 学生，最近刚开始学这些技术，如果问的问题太菜，大家见谅。
: 这次把我total RNA的结果贴上来，让大家看看rna的质量怎么样。关于purity, 260/
: 280>=1.7。然后浓度在600ug/ml左右。大家觉着我这个total rna能用来RT吗？
: 最近还是没有什么进展，我怀疑是reverse transcription有问题。大家有没有推荐的
: 酶？我目前用的new england biolab的kit.
: 图片里的marker也贴上了。
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w***7
发帖数: 463 | 21 老板穷? fire him.
的。
【在 c*****n 的大作中提到】
:
: 网上没有看到卖我们这个clone的。应该可以花2k左右定制，但是老板穷，不会掏钱的。
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n********k
发帖数: 2818 | 22 I could do it for $200:)))
的。
【在 c*****n 的大作中提到】
:
: 网上没有看到卖我们这个clone的。应该可以花2k左右定制，但是老板穷，不会掏钱的。
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c******r
发帖数: 3778 | 23 OK，所以目的是clone a gene，right？
那就分段clone啊，中间找几个unique的enzyme cutting site，分段clone了一拼，一
个月吧最多了。比你一次5kb容易多了
的。
【在 c*****n 的大作中提到】
:
: 网上没有看到卖我们这个clone的。应该可以花2k左右定制，但是老板穷，不会掏钱的。
|
n********k
发帖数: 2818 | 24 it takes less than a day to piece them together with two rounds of fusion
PCR...
【在 c******r 的大作中提到】
: OK，所以目的是clone a gene，right？
: 那就分段clone啊，中间找几个unique的enzyme cutting site，分段clone了一拼，一
: 个月吧最多了。比你一次5kb容易多了
:
: 的。
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c******r
发帖数: 3778 | 25 well, true, but only if everything goes smoothly, which I'm highly doubt for
him:)
【在 n********k 的大作中提到】
: it takes less than a day to piece them together with two rounds of fusion
: PCR...
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