y****m
发帖数: 37 | 1 首先要说明的是此文不针对任何个人，只对science。我真心希望韩的文章可以被重复
，而自己也在试着重复。
对于这片文章，我本人有一下几点疑问，看看那位高人能解答一下：
1.一般来说Ago蛋白C端加tag，无论是来自于那个物种，蛋白就没有活性了，主要由Ago
蛋白自身结构folding决定。文中用的几个construct，好像只有1-2个C端是没有tag的
。那么，用C端带tag的Ago作出的实验，是否有意义呢？当然，不能够排除NgAgo本身特
殊，能够tolerate C端tag，只是从预测的结构上讲，可能性很小。
2.Ago催化酶切的核心domain实际是一个RNaseH fold，催化cleavage时应该结合双链（
无论DNA或RNA），而双链其中一个是guide，另外一个是target。我无法想象gDNA
guided NgAgo是如何切割双链DNA的。文章开始用2个guide，也许还有些道理（说不定
细胞DNA会有瞬时的单链状态）；后来直接上一个guide也能行，确实比较神奇。当然，
不能够排除NgAgo本身特殊，就是能够切双链，只是从其类似蛋白结构上讲，可能性很
小。
3.文章说如果同时转入Ago表达质粒和gDNA，就能行。如果先转Ago质粒，8小时候再转
gDNA，就不行。这里我无法理解。难道先转Ago质粒8小时候，这个质粒就不表达了？如
果继续表达，那8小时候再加gDNA跟同时一起转细胞又有什么区别呢？难道
transfection效率太低，以至于2次transfect的东西无法进入同一细胞，因而不行？至
少从这个角度来讲，文章的一个主要figure的结果有点奇怪。
4. Minor points:文章用bacteria codon 的construct在真核细胞表达蛋白，能有表达
真心不容易。如果用humanized codon，效果岂不更好？文末作者declare no
financial interest，如果这个东西将来有大用途了，还不能有专利呀，太失策了。
希望大家轻拍。 |
d********m
发帖数: 3662 | 2 我有个做类似工作的朋友也提到了第二点。我不了解，就不评价了。帮楼主顶一下，希
望能看到更多类似的争论。 |
e****s
发帖数: 1125 | 3 这个领域不懂。
两个比较通用的质疑：
LZ提的第一点，非常的武断。就算真有这方面的研究，随便说到"无论来自于那个物种
，蛋白就没有活性了。" 这种结论是很难随便做的。Tag种类也很多。
第4点，所谓原核、真核code的质疑。只是一个usage的问题。能够表达太正常了。
Ago
【在 y****m 的大作中提到】
: 首先要说明的是此文不针对任何个人，只对science。我真心希望韩的文章可以被重复
: ，而自己也在试着重复。
: 对于这片文章，我本人有一下几点疑问，看看那位高人能解答一下：
: 1.一般来说Ago蛋白C端加tag，无论是来自于那个物种，蛋白就没有活性了，主要由Ago
: 蛋白自身结构folding决定。文中用的几个construct，好像只有1-2个C端是没有tag的
: 。那么，用C端带tag的Ago作出的实验，是否有意义呢？当然，不能够排除NgAgo本身特
: 殊，能够tolerate C端tag，只是从预测的结构上讲，可能性很小。
: 2.Ago催化酶切的核心domain实际是一个RNaseH fold，催化cleavage时应该结合双链（
: 无论DNA或RNA），而双链其中一个是guide，另外一个是target。我无法想象gDNA
: guided NgAgo是如何切割双链DNA的。文章开始用2个guide，也许还有些道理（说不定
|
c********6
发帖数: 693 | 4 楼主，我有一个不懂 的地方，可能是common sense，但是我正好不懂，不要见笑。
1.一般来说Ago蛋白C端加tag，无论是来自于那个物种，蛋白就没有活性了，主要由Ago
蛋白自身结构folding决定。文中用的几个construct，好像只有1-2个C端是没有tag的
。那么，用C端带tag的Ago作出的实验，是否有意义呢？当然，不能够排除NgAgo本身特
殊，能够tolerate C端tag，只是从预测的结构上讲，可能性很小。
有没有paper报道在Ago蛋白的C端加tag会使其活性消失或者降低？最好在这里列几篇参
考文献。因为我以前对于好几个蛋白质在C端加FLAG,GFP，都不会影响蛋白的功能，对
于Ago家族的蛋白，我不了解。
2.Ago催化酶切的核心domain实际是一个RNaseH fold，催化cleavage时应该结合双链（
无论DNA或RNA），而双链其中一个是guide，另外一个是target。我无法想象gDNA
guided NgAgo是如何切割双链DNA的。文章开始用2个guide，也许还有些道理（说不定
细胞DNA会有瞬时的单链状态）；后来直接上一个guide也能行，确实比较神奇。当然，
不能够排除NgAgo本身特殊，就是能够切双链，只是从其类似蛋白结构上讲，可能性很
小。
http://www.nature.com/nature/journal/v507/n7491/full/nature1297
Tt-Ago 确实是一次只能切ssDNA造成nicking，这篇文章的figure中使用了一对5‘-P-
siDNA guides（FW and RV）。
3.文章说如果同时转入Ago表达质粒和gDNA，就能行。如果先转Ago质粒，8小时候再转
gDNA，就不行。这里我无法理解。难道先转Ago质粒8小时候，这个质粒就不表达了？如
果继续表达，那8小时候再加gDNA跟同时一起转细胞又有什么区别呢？难道
transfection效率太低，以至于2次transfect的东西无法进入同一细胞，因而不行？至
少从这个角度来讲，文章的一个主要figure的结果有点奇怪。
这个有可能是两次转染对于细胞的伤害太大。既然同时转染能行，为什么要分步转，逻
辑不通。
4. Minor points:文章用bacteria codon 的construct在真核细胞表达蛋白，能有表达
真心不容易。如果用humanized codon，效果岂不更好？文末作者declare no
financial interest，如果这个东西将来有大用途了，还不能有专利呀，太失策了。
这个human code optimization好像不会特别影响结果，我之前在查那个用于阴性筛选
的DTK基因就没有经过人源化的优化，也能够起作用。
我还是很担心这篇文章有问题，现在闹得这么大，万一一旦被大家确证不可重复的话，
对于国内的科研单位甚至于在海外的华人都将产生无法估量的影响。虽然说日本的小保
方晴子的造假貌似对日本科研界影响不大，但是中国国情不一样，老外本身就是带着有
色眼镜看中国。希望不要出问题。 |
y****m
发帖数: 37 | 5
这个RNAi领域内的人都知道的。其它蛋白当然可以C端加tag，但是ago这类蛋白比较特
殊，就算C端加一个aa，也会失活的，因为影响蛋白folding，这个是有结构和功能实验
支持的。可能说无论哪个物种有点绝对，至少是我见过的Ago（来自yeast，bacteria，
insect，mammal 的等等）都这样（当然，NgAgo除外）。
所以说是minor point么。
【在 e****s 的大作中提到】
: 这个领域不懂。
: 两个比较通用的质疑：
: LZ提的第一点，非常的武断。就算真有这方面的研究，随便说到"无论来自于那个物种
: ，蛋白就没有活性了。" 这种结论是很难随便做的。Tag种类也很多。
: 第4点，所谓原核、真核code的质疑。只是一个usage的问题。能够表达太正常了。
:
: Ago
|
y****m
发帖数: 37 | 6
楼主，我有一个不懂 的地方，可能是common sense，但是我正好不懂，不要见笑。
1.一般来说Ago蛋白C端加tag，无论是来自于那个物种，蛋白就没有活性了，主要由Ago
蛋白自身结构folding决定。文中用的几个construct，好像只有1-2个C端是没有tag的
。那么，用C端带tag的Ago作出的实验，是否有意义呢？当然，不能够排除NgAgo本身特
殊，能够tolerate C端tag，只是从预测的结构上讲，可能性很小。
有没有paper报道在Ago蛋白的C端加tag会使其活性消失或者降低？最好在这里列几篇参
考文献。因为我以前对于好几个蛋白质在C端加FLAG,GFP，都不会影响蛋白的功能，对
于Ago家族的蛋白，我不了解。
----见上
2.Ago催化酶切的核心domain实际是一个RNaseH fold，催化cleavage时应该结合双链（
无论DNA或RNA），而双链其中一个是guide，另外一个是target。我无法想象gDNA
guided NgAgo是如何切割双链DNA的。文章开始用2个guide，也许还有些道理（说不定
细胞DNA会有瞬时的单链状态）；后来直接上一个guide也能行，确实比较神奇。当然，
不能够排除NgAgo本身特殊，就是能够切双链，只是从其类似蛋白结构上讲，可能性很
小。
http://www.nature.com/nature/journal/v507/n7491/full/nature1297
Tt-Ago 确实是一次只能切ssDNA造成nicking，这篇文章的figure中使用了一对5‘-P-
siDNA guides（FW and RV）。
3.文章说如果同时转入Ago表达质粒和gDNA，就能行。如果先转Ago质粒，8小时候再转
gDNA，就不行。这里我无法理解。难道先转Ago质粒8小时候，这个质粒就不表达了？如
果继续表达，那8小时候再加gDNA跟同时一起转细胞又有什么区别呢？难道
transfection效率太低，以至于2次transfect的东西无法进入同一细胞，因而不行？至
少从这个角度来讲，文章的一个主要figure的结果有点奇怪。
这个有可能是两次转染对于细胞的伤害太大。既然同时转染能行，为什么要分步转，逻
辑不通。
－－－不是我要分步转，是文章分步转，我也不明白为毛作者要这样搞。我猜测是否先
做的分步转，可能开始作者认为理论上蛋白表达需要时间，一般8小时可有表达，再加
gDNA就正好形成complex；如果同时转，gDNA不稳定，等蛋白有表达了就都降解了。可
是实验做出来同时转的反而work了。
4. Minor points:文章用bacteria codon 的construct在真核细胞表达蛋白，能有表达
真心不容易。如果用humanized codon，效果岂不更好？文末作者declare no
financial interest，如果这个东西将来有大用途了，还不能有专利呀，太失策了。
这个human code optimization好像不会特别影响结果，我之前在查那个用于阴性筛选
的DTK基因就没有经过人源化的优化，也能够起作用。
【在 c********6 的大作中提到】
: 楼主，我有一个不懂 的地方，可能是common sense，但是我正好不懂，不要见笑。
: 1.一般来说Ago蛋白C端加tag，无论是来自于那个物种，蛋白就没有活性了，主要由Ago
: 蛋白自身结构folding决定。文中用的几个construct，好像只有1-2个C端是没有tag的
: 。那么，用C端带tag的Ago作出的实验，是否有意义呢？当然，不能够排除NgAgo本身特
: 殊，能够tolerate C端tag，只是从预测的结构上讲，可能性很小。
: 有没有paper报道在Ago蛋白的C端加tag会使其活性消失或者降低？最好在这里列几篇参
: 考文献。因为我以前对于好几个蛋白质在C端加FLAG,GFP，都不会影响蛋白的功能，对
: 于Ago家族的蛋白，我不了解。
: 2.Ago催化酶切的核心domain实际是一个RNaseH fold，催化cleavage时应该结合双链（
: 无论DNA或RNA），而双链其中一个是guide，另外一个是target。我无法想象gDNA
|
c**i
发帖数: 265 | 7 codon optimization 从真核到原核是必要的，从原核到真核不必要。像HEK这种各种
tRNA都很多，没必要，特别在年均实验经费3万，各种variants都靠PCR from strain的
情况下。 |
f*******e
发帖数: 109 | 8 这个AGO是比较奇怪，体外只能切单链，体内切双链。而且切的位点并不特异。从细菌
里纯化的该Ago看，蛋白是aggregate的，我们怀疑该蛋白对细菌有毒性（这也很能理解
，细菌里可能有很多5'磷酸化的DNA），在细胞里需要共转的问题，是不是也有可能是
因为毒性问题？共转的时候5'磷酸化的DNA相当于decoy DNA和细胞里的核酸竞争性结合
Ago,从而减轻Ago的毒性，要是这样，Ago还是有毒性的。 |
l*******1
发帖数: 16217 | |
K**R
发帖数: 193 | 10 唉， 真理解了 通常 reviewer 3 怎么来了。 |
|
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y****m
发帖数: 37 | 11 俺这个怎么也比reviewer3的水平高几个档次吧，好歹还是scientific的comments
【在 K**R 的大作中提到】
: 唉， 真理解了 通常 reviewer 3 怎么来了。
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x***m
发帖数: 345 | 12 post to pubpeer
【在 y****m 的大作中提到】
: 俺这个怎么也比reviewer3的水平高几个档次吧，好歹还是scientific的comments
|
c********6
发帖数: 693 | 13 我也觉得你提的意见比较专业，不像是为了criticize而criticize。 作者唯一正确的
做法就是解释
【在 y****m 的大作中提到】
: 俺这个怎么也比reviewer3的水平高几个档次吧，好歹还是scientific的comments
|
m****a
发帖数: 270 | 14 你可能理解错了，这个AGO在体外并非只能切单链，作者发现转染NgAgO和ssDNA的293细
胞中提取出的NgAgo能在“体外”切割双链质粒（Supplementary Figure 1）。
另外NgAgo并不能切单链DNA，这一点和TtAgo就完全不同。
【在 f*******e 的大作中提到】
: 这个AGO是比较奇怪，体外只能切单链，体内切双链。而且切的位点并不特异。从细菌
: 里纯化的该Ago看，蛋白是aggregate的，我们怀疑该蛋白对细菌有毒性（这也很能理解
: ，细菌里可能有很多5'磷酸化的DNA），在细胞里需要共转的问题，是不是也有可能是
: 因为毒性问题？共转的时候5'磷酸化的DNA相当于decoy DNA和细胞里的核酸竞争性结合
: Ago,从而减轻Ago的毒性，要是这样，Ago还是有毒性的。
|
c********6
发帖数: 693 | 15 继续扯淡
【在 m****a 的大作中提到】
: 你可能理解错了，这个AGO在体外并非只能切单链，作者发现转染NgAgO和ssDNA的293细
: 胞中提取出的NgAgo能在“体外”切割双链质粒（Supplementary Figure 1）。
: 另外NgAgo并不能切单链DNA，这一点和TtAgo就完全不同。
|
m****a
发帖数: 270 | 16 对于第三点你没仔细看论文吧？
看了一下论文，作者先转Ago，然后分别在12h和24h转gDNA，fig 2b显示12h无影响，但
是24h load的gDNA明显减少。
作者的解释是NGAgo 装载gDNA可能需要在翻译折叠的阶段进行，所以如果后转染gDNA可
能导致体内已经成熟的Ago无法结合gDNA，这也解释了为什么体外纯化的Ago蛋白无法在
37C装载gDNA，而只能55C装载，代价是可能导致蛋白部分失活变成一个Nikase。
另外作者在supplemental里面也提到了可以通过再次转染gDNA的方法提高效率。
3.文章说如果同时转入Ago表达质粒和gDNA，就能行。如果先转Ago质粒，8小时候再转
gDNA，就不行。这里我无法理解。难道先转Ago质粒8小时候，这个质粒就不表达了？如
果继续表达，那8小时候再加gDNA跟同时一起转细胞又有什么区别呢？难道
transfection效率太低，以至于2次transfect的东西无法进入同一细胞，因而不行？至
少从这个角度来讲，文章的一个主要figure的结果有点奇怪。
【在 y****m 的大作中提到】
: 俺这个怎么也比reviewer3的水平高几个档次吧，好歹还是scientific的comments
|
m****a
发帖数: 270 | 17 不扯淡，纯粹讨论科学，如果我说的不对你可以反驳。
【在 c********6 的大作中提到】
: 继续扯淡
|
y****m
发帖数: 37 | 18 可是问题是24h的时候，NGAgo质粒应该还在继续表达mRNA，其mRNA还在继续翻译，那作
者的
所谓“装载gDNA可能需要在翻译折叠的阶段进行”解释就说不通，因为无论何时转gDNA
都有正在翻译折叠的NGAGO来结合gDNA的。“再次转染gDNA提高效率”的现象难道不是
和先后转gDNA和NGAGO的结果相悖么？
其实说多无益，做出来才是硬道理。
【在 m****a 的大作中提到】
: 对于第三点你没仔细看论文吧？
: 看了一下论文，作者先转Ago，然后分别在12h和24h转gDNA，fig 2b显示12h无影响，但
: 是24h load的gDNA明显减少。
: 作者的解释是NGAgo 装载gDNA可能需要在翻译折叠的阶段进行，所以如果后转染gDNA可
: 能导致体内已经成熟的Ago无法结合gDNA，这也解释了为什么体外纯化的Ago蛋白无法在
: 37C装载gDNA，而只能55C装载，代价是可能导致蛋白部分失活变成一个Nikase。
: 另外作者在supplemental里面也提到了可以通过再次转染gDNA的方法提高效率。
:
: 3.文章说如果同时转入Ago表达质粒和gDNA，就能行。如果先转Ago质粒，8小时候再转
: gDNA，就不行。这里我无法理解。难道先转Ago质粒8小时候，这个质粒就不表达了？如
|
e****s
发帖数: 1125 | 19 这个Ago蛋白C端加额外的AA会失活，有文献吗？
感觉比较怪。始终觉得不会有这么绝对。
你的这些质疑，都不是很Solid的质疑。Opinions的东西远远大于Facts.
【在 y****m 的大作中提到】
: 可是问题是24h的时候，NGAgo质粒应该还在继续表达mRNA，其mRNA还在继续翻译，那作
: 者的
: 所谓“装载gDNA可能需要在翻译折叠的阶段进行”解释就说不通，因为无论何时转gDNA
: 都有正在翻译折叠的NGAGO来结合gDNA的。“再次转染gDNA提高效率”的现象难道不是
: 和先后转gDNA和NGAGO的结果相悖么？
: 其实说多无益，做出来才是硬道理。
|
y****m
发帖数: 37 | 20
这个我还真的不知道谁会发一个negative results。暂且当作RNAi行业“潜规则”吧。
1，2 两点可以从原子水平上看出，Ago结构人的bacteria的都好几个了，你还要怎么
solid？这难道不是facts？
我也说过，NgAgo有可能是例外。不明白为毛说opinions东西多。我是拿science说事，
又不是拿“质疑”说事。
希望你再评论的话，stick to science。
谢谢！
【在 e****s 的大作中提到】
: 这个Ago蛋白C端加额外的AA会失活，有文献吗？
: 感觉比较怪。始终觉得不会有这么绝对。
: 你的这些质疑，都不是很Solid的质疑。Opinions的东西远远大于Facts.
|
|
|
m****a
发帖数: 270 | 21 我的个人理解是：转染质粒表达一般24小时到高峰，12小时还在增长期，此时转染gDNA
还能和新合成的Ago结合，24小时以后假如Ago蛋白turnover 的速率不够快，那就会导
致后转的 gDNA loading效率下降的问题。
再次转染说的是knockin实验，推荐在24小时的时候再次转gDNA是为了让更多的新合成
的Ago和gDNA结合，能起多大作用不知道，但并不矛盾。
NGAGO结合gDNA以及切割DNA的机制不清楚，肯定得继续接着做。
gDNA
【在 y****m 的大作中提到】
: 可是问题是24h的时候，NGAgo质粒应该还在继续表达mRNA，其mRNA还在继续翻译，那作
: 者的
: 所谓“装载gDNA可能需要在翻译折叠的阶段进行”解释就说不通，因为无论何时转gDNA
: 都有正在翻译折叠的NGAGO来结合gDNA的。“再次转染gDNA提高效率”的现象难道不是
: 和先后转gDNA和NGAGO的结果相悖么？
: 其实说多无益，做出来才是硬道理。
|
e****s
发帖数: 1125 | 22 没想和你讨论过头了。算我用词过分了，但自认为我蛮Stick to science。确实我感觉
很多Opinions的东西在你一楼的评论里被当成Facts。
说来说去，其实没有任何证据表明Ago家族蛋白不能接C-Term tags. Tag种类很多，和
蛋白间的Linker设计有时候也很关键。
【在 y****m 的大作中提到】
:
: 这个我还真的不知道谁会发一个negative results。暂且当作RNAi行业“潜规则”吧。
: 1，2 两点可以从原子水平上看出，Ago结构人的bacteria的都好几个了，你还要怎么
: solid？这难道不是facts？
: 我也说过，NgAgo有可能是例外。不明白为毛说opinions东西多。我是拿science说事，
: 又不是拿“质疑”说事。
: 希望你再评论的话，stick to science。
: 谢谢！
|
w***a
发帖数: 4361 | 23 真牛啊，这个话题带出来一堆马甲。韩的paper 5月2号上线，
你都重复了一周的实验？ 你从头合成的质粒？ |
w***a
发帖数: 4361 | 24 拜托，不要再秀智商了好伐。
你干脆说是你韩paper的reviewer好了，一年以前就知道这个事。 |
y****m
发帖数: 37 | 25
怎么跟你说呢，就是研究RNAi机制的很多实验室开始都是试过N－tag或C－tag的
Agonaute，结果发现只有N－tag功能上可以rescue 其mutant，也只有N端tag的体外有
活性，而C端tag的都不行。这种C端不work的结果确实不忍心发表出来了，所以才叫潜
规则么。如果你周围有懂RNAi的，可以去问一问我说的对不对。
后来好几个不同物种的Ago结构都解出来了，发现C端确实被包裹在一个domain里面以至
于多一个aa的空间也没有。不知道这些算不算证据。如果opinion是有facts支持的，不
知道算什么opinion呢？（right opinion？）
当然，说了这么多也不能排除NgAgo是个特例，尽管从NgAgo序列上没看出它与其它Ago
能有这么大区别的。
其实我也就是闲得无聊讨论一下paper，最后人家实验重复出来了，比我这里多少
opinion都关用。
【在 e****s 的大作中提到】
: 没想和你讨论过头了。算我用词过分了，但自认为我蛮Stick to science。确实我感觉
: 很多Opinions的东西在你一楼的评论里被当成Facts。
: 说来说去，其实没有任何证据表明Ago家族蛋白不能接C-Term tags. Tag种类很多，和
: 蛋白间的Linker设计有时候也很关键。
|
w***a
发帖数: 4361 | 26 我去，刚才那个马甲自己删帖跑了。。。
这帮人跑这里造谣是什么心态？ 完全捞不着任何好处啊。
【在 w***a 的大作中提到】
: 拜托，不要再秀智商了好伐。
: 你干脆说是你韩paper的reviewer好了，一年以前就知道这个事。
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j***8
发帖数: 222 | 27 是比较难理解，是不是以前在哪里受了什么委屈，还是放下的好。
【在 w***a 的大作中提到】
: 我去，刚才那个马甲自己删帖跑了。。。
: 这帮人跑这里造谣是什么心态？ 完全捞不着任何好处啊。
|
n******7
发帖数: 12463 | 28 羡慕嫉妒恨？
还是怕被人肉？
不管哪个原因，都够猥琐的
【在 w***a 的大作中提到】
: 我去，刚才那个马甲自己删帖跑了。。。
: 这帮人跑这里造谣是什么心态？ 完全捞不着任何好处啊。
|
K**R
发帖数: 193 | 29 有些人，对待自己文章永远是一座心态。对待别人的东西永远是reviewer 3 心态。 |
y****m
发帖数: 37 | 30 看来是文章悲剧多了，有心理阴影吧。我记得NIBS某人说过一句话，文章被reviewer锯
掉，某种程度上说明是自己还做得还不够好。换言之，为毛非要怪reviewer3呢？
明明说了是讨论science，有些人非要扯上一下无关的东西，有本事说点跟文章内容直
接相关的？不要老是含沙射影的，实在是没劲。
【在 K**R 的大作中提到】
: 有些人，对待自己文章永远是一座心态。对待别人的东西永远是reviewer 3 心态。
|
|
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K**R
发帖数: 193 | 31
你说的没错，我激动了。你继续science把
【在 y****m 的大作中提到】
: 看来是文章悲剧多了，有心理阴影吧。我记得NIBS某人说过一句话，文章被reviewer锯
: 掉，某种程度上说明是自己还做得还不够好。换言之，为毛非要怪reviewer3呢？
: 明明说了是讨论science，有些人非要扯上一下无关的东西，有本事说点跟文章内容直
: 接相关的？不要老是含沙射影的，实在是没劲。
|
w***a
发帖数: 4361 | 32 NIBS这人是受虐狂吧。
要故意刁难的话，你说啥paper我不能写上三页纸的comments？
【在 y****m 的大作中提到】
: 看来是文章悲剧多了，有心理阴影吧。我记得NIBS某人说过一句话，文章被reviewer锯
: 掉，某种程度上说明是自己还做得还不够好。换言之，为毛非要怪reviewer3呢？
: 明明说了是讨论science，有些人非要扯上一下无关的东西，有本事说点跟文章内容直
: 接相关的？不要老是含沙射影的，实在是没劲。
|
y****m
发帖数: 37 | 33 似乎有点受虐倾向的意思。
说此话人当时主要是在回忆自己以前发的文章，有些没发到最好journal，当年觉得不
平不公；可回过头来看，自己现在觉得应该可以做得更好。所以有感而言，虽然
reviewer当初可能有些故意刁难，现在觉得反而对自己的science是个鞭策，因此他现
在的目标就是做到完美让人无话可说。
【在 w***a 的大作中提到】
: NIBS这人是受虐狂吧。
: 要故意刁难的话，你说啥paper我不能写上三页纸的comments？
|
f*******e
发帖数: 109 | 34 AGO的催化位点是保守的，为什么所有细胞内外的实验里，都没有做催化位点突变了的
AGO的活性检测呢？做了两次，细菌纯化的蛋白确实没看到活性，蛋白是aggregate的。 |
y****m
发帖数: 37 | 35 提得好，文章这个重要control确实没有。
【在 f*******e 的大作中提到】
: AGO的催化位点是保守的，为什么所有细胞内外的实验里，都没有做催化位点突变了的
: AGO的活性检测呢？做了两次，细菌纯化的蛋白确实没看到活性，蛋白是aggregate的。
|
c********6
发帖数: 693 | 36 你没有看韩春雨刚做的报告吗？人家是需要高超的技艺的！！！！！高超的技艺！！！
！！高超！！！！！高！！！！！
【在 f*******e 的大作中提到】
: AGO的催化位点是保守的，为什么所有细胞内外的实验里，都没有做催化位点突变了的
: AGO的活性检测呢？做了两次，细菌纯化的蛋白确实没看到活性，蛋白是aggregate的。
|
p*******n
发帖数: 129 | 37 我觉得你攻击韩的位点都挺弱的，有没有一点真材实料？怀疑韩的数据，又说不出个所
以然，只是在那里干嚎... 你跟楼上的那些有水平的评论差太多了，如果能评论点带水
平的料，那才是搞科研的样子...
【在 c********6 的大作中提到】
: 你没有看韩春雨刚做的报告吗？人家是需要高超的技艺的！！！！！高超的技艺！！！
: ！！高超！！！！！高！！！！！
|
c********6
发帖数: 693 | 38 你有你的发言权利
【在 p*******n 的大作中提到】
: 我觉得你攻击韩的位点都挺弱的，有没有一点真材实料？怀疑韩的数据，又说不出个所
: 以然，只是在那里干嚎... 你跟楼上的那些有水平的评论差太多了，如果能评论点带水
: 平的料，那才是搞科研的样子...
|
v*******e
发帖数: 11604 | 39
但是提高超的技艺给人的感觉不好。
【在 p*******n 的大作中提到】
: 我觉得你攻击韩的位点都挺弱的，有没有一点真材实料？怀疑韩的数据，又说不出个所
: 以然，只是在那里干嚎... 你跟楼上的那些有水平的评论差太多了，如果能评论点带水
: 平的料，那才是搞科研的样子...
|
c****r
发帖数: 9 | 40 请发个链接。谢谢
【在 c********6 的大作中提到】
: 你没有看韩春雨刚做的报告吗？人家是需要高超的技艺的！！！！！高超的技艺！！！
: ！！高超！！！！！高！！！！！
|
|
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p*******n
发帖数: 129 | 41 那没办法，其他人没有做出Nature Biotech的NB工作，人家做出来了，当然牛逼了，而
且之前不是爆料几年前河北科技大学的学生评论韩教授上课的时候就是有点口出狂言的
感觉...这是个人性格问题，你不能因为人家的个性而去怀疑他的实验数据，这两者根
本就没有逻辑关系。科学史上性格张狂怪癖但又牛逼闪闪的人多了去了...
【在 v*******e 的大作中提到】
:
: 但是提高超的技艺给人的感觉不好。
|
l*******1
发帖数: 16217 | |
l*******1
发帖数: 16217 | |
c********6
发帖数: 693 | |
c********6
发帖数: 693 | 45 结果已经比较明显了。我很怀疑国内那些说已经重复出来了的，究竟是在哪里听到的。
现在国外的重复结果是一边倒的否定Ng-Ago |
j*********g
发帖数: 463 | 46 韩春雨的工作到底怎么让你的工作失去价值了，你急成这样。
北大魏老师（做CRISPR screen的）已经重复出来了；酶的点突变失活实验生物物理所
也在做了。
你生气也没用，lol
[在 crispr2016 () 的大作中提到：]
:结果已经比较明显了。我很怀疑国内那些说已经重复出来了的，究竟是在哪里听到的
。现在国外的重复结果是一边倒的否定Ng-Ago |
l******r
发帖数: 18699 | 47 太好了！
【在 j*********g 的大作中提到】
: 韩春雨的工作到底怎么让你的工作失去价值了，你急成这样。
: 北大魏老师（做CRISPR screen的）已经重复出来了；酶的点突变失活实验生物物理所
: 也在做了。
: 你生气也没用，lol
: [在 crispr2016 () 的大作中提到：]
: :结果已经比较明显了。我很怀疑国内那些说已经重复出来了的，究竟是在哪里听到的
: 。现在国外的重复结果是一边倒的否定Ng-Ago
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D**A
发帖数: 311 | 48 哈哈哈， 太精辟了
【在 K**R 的大作中提到】
: 有些人，对待自己文章永远是一座心态。对待别人的东西永远是reviewer 3 心态。
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c********6
发帖数: 693 | 49 北大的魏老师压根就没有说他们重复出来了，我怎么听到的是魏老师说没有重复出来呢
【在 j*********g 的大作中提到】
: 韩春雨的工作到底怎么让你的工作失去价值了，你急成这样。
: 北大魏老师（做CRISPR screen的）已经重复出来了；酶的点突变失活实验生物物理所
: 也在做了。
: 你生气也没用，lol
: [在 crispr2016 () 的大作中提到：]
: :结果已经比较明显了。我很怀疑国内那些说已经重复出来了的，究竟是在哪里听到的
: 。现在国外的重复结果是一边倒的否定Ng-Ago
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z*******q
发帖数: 16 | 50 真受不了这群喷子，本来是想好好谈论一下实验的，但是一旦提到任何对韩不利的事情
，就开始喷起来了，任何一个真正有用的成果都是应该能够接受大众检验，经得起别人
重复才行。
【在 c********6 的大作中提到】
: 北大的魏老师压根就没有说他们重复出来了，我怎么听到的是魏老师说没有重复出来呢
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c********6
发帖数: 693 | 51 啪啪打脸，你压根都不知道自己在说什么吧。他们自己敢那么大胆子的造假，为什么不
能质疑，现在这么多实验室提出无法重复他的实验结果，请问，他有出来解释吗？？？
？？真的是他们的技艺高超吗？？？？绝世功夫吗？？？？只有中指最适合他
【在 z*******q 的大作中提到】
: 真受不了这群喷子，本来是想好好谈论一下实验的，但是一旦提到任何对韩不利的事情
: ，就开始喷起来了，任何一个真正有用的成果都是应该能够接受大众检验，经得起别人
: 重复才行。
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z*******q
发帖数: 16 | 52 哥们，你误会了，我是说楼上那位，我们也是重复了一个多月没有重复出来，时间经费
都浪费进去了。非常生气。跟其他同行的组交流，他们也都没有阳性的结果，大家都非
常气愤，早在几周之前我就在这个帖子里说，我们重复不了他的实验。我们是国内第一
批开始follow的，想跟大家一起讨论一下为何无法重复的问题，还被那群喷子给喷了。
【在 c********6 的大作中提到】
: 啪啪打脸，你压根都不知道自己在说什么吧。他们自己敢那么大胆子的造假，为什么不
: 能质疑，现在这么多实验室提出无法重复他的实验结果，请问，他有出来解释吗？？？
: ？？真的是他们的技艺高超吗？？？？绝世功夫吗？？？？只有中指最适合他
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c********6
发帖数: 693 | 53 我们都是正义的人。看国内的媒体如何收场
【在 z*******q 的大作中提到】
: 哥们，你误会了，我是说楼上那位，我们也是重复了一个多月没有重复出来，时间经费
: 都浪费进去了。非常生气。跟其他同行的组交流，他们也都没有阳性的结果，大家都非
: 常气愤，早在几周之前我就在这个帖子里说，我们重复不了他的实验。我们是国内第一
: 批开始follow的，想跟大家一起讨论一下为何无法重复的问题，还被那群喷子给喷了。
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C****5
发帖数: 32 | 54 我们也是重复了一个多月没有重复出来,非常生气。 |
c********6
发帖数: 693 | 55 https://groups.google.com/forum/#!forum/ngago
你把你做的方法和实验结果贴到这里去嘛，如果是因为韩春雨所说的需要高超的技巧（
等我笑一会），说不定会有人给你提出修改意见，其他的同行业可以直接跟你交流。
【在 C****5 的大作中提到】
: 我们也是重复了一个多月没有重复出来,非常生气。
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z*******q
发帖数: 16 | 56 已跟帖，如果真的有人重复出来确切的结果，请指点
【在 c********6 的大作中提到】
: https://groups.google.com/forum/#!forum/ngago
: 你把你做的方法和实验结果贴到这里去嘛，如果是因为韩春雨所说的需要高超的技巧（
: 等我笑一会），说不定会有人给你提出修改意见，其他的同行业可以直接跟你交流。
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c********6
发帖数: 693 | 57 你们跟帖最好用英语啊，不要欺负外国人
【在 z*******q 的大作中提到】
: 已跟帖，如果真的有人重复出来确切的结果，请指点
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y****m
发帖数: 37 | 58 1.本人用codon optimuzed NgAgo试了2次，没重复出来。如果需要“高超实验技术”才
可做出来的话，我宁可用crispr，因为第一次就试出来了。
2.文章没有使用活性缺失的ago做control，韩看到的“突变”是否有可能是ago
cleavage independent？因为韩用的C末端加tag的ago不应该有酶活性的。
3.听闻11g说2月后可能有对韩工作的明确定论。难道他们结构要出来了？
【在 c********6 的大作中提到】
: 你们跟帖最好用英语啊，不要欺负外国人
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S**********e
发帖数: 620 | 59 如果真是假的，那太耽误时间和精力了，做老板的还好，底下干活的人会想揍人的。
【在 z*******q 的大作中提到】
: 哥们，你误会了，我是说楼上那位，我们也是重复了一个多月没有重复出来，时间经费
: 都浪费进去了。非常生气。跟其他同行的组交流，他们也都没有阳性的结果，大家都非
: 常气愤，早在几周之前我就在这个帖子里说，我们重复不了他的实验。我们是国内第一
: 批开始follow的，想跟大家一起讨论一下为何无法重复的问题，还被那群喷子给喷了。
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l******r
发帖数: 18699 | 60 我不是针对任何人。我是说这里所有的人都是傻逼。--楼主
Ago
【在 y****m 的大作中提到】
: 首先要说明的是此文不针对任何个人，只对science。我真心希望韩的文章可以被重复
: ，而自己也在试着重复。
: 对于这片文章，我本人有一下几点疑问，看看那位高人能解答一下：
: 1.一般来说Ago蛋白C端加tag，无论是来自于那个物种，蛋白就没有活性了，主要由Ago
: 蛋白自身结构folding决定。文中用的几个construct，好像只有1-2个C端是没有tag的
: 。那么，用C端带tag的Ago作出的实验，是否有意义呢？当然，不能够排除NgAgo本身特
: 殊，能够tolerate C端tag，只是从预测的结构上讲，可能性很小。
: 2.Ago催化酶切的核心domain实际是一个RNaseH fold，催化cleavage时应该结合双链（
: 无论DNA或RNA），而双链其中一个是guide，另外一个是target。我无法想象gDNA
: guided NgAgo是如何切割双链DNA的。文章开始用2个guide，也许还有些道理（说不定
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Z***L
发帖数: 9 | 61
Ago
半路插进来说一下，刚刚听说Ago C末端不能多任何序列呢。。。。
不过在addgene上查了一下，不但14年TtAgo在c末端有多了几个序列还有6*his标签，然
后在addgene上搜索ago，在搜到的结果里，随便找几个质粒，各种tag，各种标签，c末
端哦，sv40，flag，his。。you name it.......
所以楼主是不是获取的信息上有什么错误。。。
【在 y****m 的大作中提到】
: 1.本人用codon optimuzed NgAgo试了2次，没重复出来。如果需要“高超实验技术”才
: 可做出来的话，我宁可用crispr，因为第一次就试出来了。
: 2.文章没有使用活性缺失的ago做control，韩看到的“突变”是否有可能是ago
: cleavage independent？因为韩用的C末端加tag的ago不应该有酶活性的。
: 3.听闻11g说2月后可能有对韩工作的明确定论。难道他们结构要出来了？
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y****m
发帖数: 37 | 62 doesn't mean they are functional, though
plus, I don't know which plasmid you checked for the 14 TtAGO but the
following one doesn't seem to contain his tag at C term.
http://www.addgene.org/53079/sequences/
I also looked at the first 2 pages of addgene ago plasmids but didn't find
any with C-term tag(some of them even specifically indicate N-term tag). Not
sure which Ago plasmids are with c-tag that you found.
【在 Z***L 的大作中提到】
:
: Ago
: 半路插进来说一下，刚刚听说Ago C末端不能多任何序列呢。。。。
: 不过在addgene上查了一下，不但14年TtAgo在c末端有多了几个序列还有6*his标签，然
: 后在addgene上搜索ago，在搜到的结果里，随便找几个质粒，各种tag，各种标签，c末
: 端哦，sv40，flag，his。。you name it.......
: 所以楼主是不是获取的信息上有什么错误。。。
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C****5
发帖数: 32 | 63 我也看了一下，没有呀？
给个链接？
【在 Z***L 的大作中提到】
:
: Ago
: 半路插进来说一下，刚刚听说Ago C末端不能多任何序列呢。。。。
: 不过在addgene上查了一下，不但14年TtAgo在c末端有多了几个序列还有6*his标签，然
: 后在addgene上搜索ago，在搜到的结果里，随便找几个质粒，各种tag，各种标签，c末
: 端哦，sv40，flag，his。。you name it.......
: 所以楼主是不是获取的信息上有什么错误。。。
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c********6
发帖数: 693 | 64 就是有人故意在挖坑
【在 C****5 的大作中提到】
: 我也看了一下，没有呀？
: 给个链接？
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a*****x
发帖数: 901 | |
P****R
发帖数: 22479 | 66 再顶/
【在 a*****x 的大作中提到】
: 楼主好神，顶一下
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c********n
发帖数: 225 | 67 截止到2016年8月24日
【记录历史】谁重复验证了NgAgo？
收集到3则“重复实验证实韩春雨组NgAgo基因编辑功能”的信息，
实例详细信息请参见：
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/32034437.html
其中：
- 1则出自“火锅哥”
o 发布人“做的中间发现了一个问题，才发现韩点播的很有道理”，实验“调整了
步骤，这在韩的paper里没有提”, 实验结果“关键是测序也和韩的报道能温和”
o 发布人许诺2016年7月22日前发布重复结果到BioRxiv
o 截止到2016年8月24日，仍无发布消息
原文链接
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/32028091.html
鉴于"科学的事情要由科学来解决”，而且Nature杂志有可能发表关于Replication实验
数据的文章， 建议发布人
- 尽快发布重复验证NgAgo实验结果
- 并联系Nature Biotechnology，尽快以publication形式公布重复验证NgAgo实验数据
- CoinByCoin
2016-08-24 |
P****R
发帖数: 22479 | 68 27500个点击，韩春雨/沈啸事件评论最高点击。
学术讨论就是能吸引到最多关注。 |
c********n
发帖数: 225 | 69 鉴于
- “澳洲哥”在第二次重复实验，无法验证NgAgo基因编辑功能之后，希望NBT文章原作
者写一个详细的protocol并参与group discussion来帮助大家troubleshoot
https://twitter.com/GaetanBurgio/status/769120770219843585
- 业界很多同行也无法重复验证NgAgo基因编辑功能
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/32034437.html
- 而由于“火锅哥”了解如何调整protocol而观察到韩春雨实验室NBT里的NgAgo基因编
辑功能
请“火锅哥”也和业界同行分享实验调整细节，帮助业界同行troubleshoot
原文链接
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/32028091.html
原文引用
“做的中间发现了一个问题，才发现韩点播的很有道理。
于是调整了步骤，这在韩的paper里没有提。恰恰是这一步调整，后续平行结果虽说
variation很大，但平均值已经比较客观。关键是测序也和韩的报道能温和。” |
C*******e
发帖数: 4348 | 70 楼主一边反复说Ago蛋白不能在C端加tag，会影响折叠而失活，一边对于大家的疑问既
不给出reference paper也不给出PDB ID，只是说有文献，有结构。。。。这样真的很
不能让人信服啊。
我不是做RNAi这一行的，好奇去搜了一下PDB，找到一个Human Argonaute2结构，4Z4D
，看了一下，C端是折叠在蛋白内部，不暴露在外的。如果所有的Ago蛋白都是这样折叠
的，那倒的确支持楼主的说法。但如果lz说的是“Ago蛋白的C端疏水，折叠在蛋白内部
，在C端加Affinity tag会影响正确折叠进而影响活性”，那大家看了一目了然，不就
没有那么多疑问了吗。
【在 y****m 的大作中提到】
: doesn't mean they are functional, though
: plus, I don't know which plasmid you checked for the 14 TtAGO but the
: following one doesn't seem to contain his tag at C term.
: http://www.addgene.org/53079/sequences/
: I also looked at the first 2 pages of addgene ago plasmids but didn't find
: any with C-term tag(some of them even specifically indicate N-term tag). Not
: sure which Ago plasmids are with c-tag that you found.
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c********n
发帖数: 225 | 71 Date：2016年04月13日（在NBT paper 上线前约2个多星期）
Title：以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术 （中国专利号CN 105483118 A）
Links:
https://www.google.com/patents/CN105483118A
https://www.google.com/patents/CN105483118A?cl=zh
Key Points：
- 沈啸、韩春雨 （浙江大学）Ago基因编辑专利发表
- 特别注明：
1. 专利filing date：Dec 21, 2015
2. 根据专利描述，不但NgAgo有基因编辑功能，HpAgo、NaAgo和NtAgo “都与NgAgo一
样有很强的编辑哺乳动物细胞内基因表达的能力”；以及MaAgo，NpAgo，NIESAgo，
SchAgo，SPAgo “等Argonaute核酸酶也能在37°C编辑DNA” |
P****R
发帖数: 22479 | 72 这个看法有意思。
这些类型的蛋白质多不多？
4Z4D
【在 C*******e 的大作中提到】
: 楼主一边反复说Ago蛋白不能在C端加tag，会影响折叠而失活，一边对于大家的疑问既
: 不给出reference paper也不给出PDB ID，只是说有文献，有结构。。。。这样真的很
: 不能让人信服啊。
: 我不是做RNAi这一行的，好奇去搜了一下PDB，找到一个Human Argonaute2结构，4Z4D
: ，看了一下，C端是折叠在蛋白内部，不暴露在外的。如果所有的Ago蛋白都是这样折叠
: 的，那倒的确支持楼主的说法。但如果lz说的是“Ago蛋白的C端疏水，折叠在蛋白内部
: ，在C端加Affinity tag会影响正确折叠进而影响活性”，那大家看了一目了然，不就
: 没有那么多疑问了吗。
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x*******6
发帖数: 994 | 73 他就会喷,讲不出专业分析.
【在 m****a 的大作中提到】
: 不扯淡，纯粹讨论科学，如果我说的不对你可以反驳。
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P****R
发帖数: 22479 | 74 他怎么喷的？
【在 x*******6 的大作中提到】
: 他就会喷,讲不出专业分析.
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P****R
发帖数: 22479 | 75 火锅哥是否就是韩春雨/沈啸？据说韩春雨/沈啸喜欢吃火锅。
【在 c********n 的大作中提到】
: 鉴于
: - “澳洲哥”在第二次重复实验，无法验证NgAgo基因编辑功能之后，希望NBT文章原作
: 者写一个详细的protocol并参与group discussion来帮助大家troubleshoot
: https://twitter.com/GaetanBurgio/status/769120770219843585
: - 业界很多同行也无法重复验证NgAgo基因编辑功能
: http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/32034437.html
: - 而由于“火锅哥”了解如何调整protocol而观察到韩春雨实验室NBT里的NgAgo基因编
: 辑功能
: 请“火锅哥”也和业界同行分享实验调整细节，帮助业界同行troubleshoot
: 原文链接
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P****R
发帖数: 22479 | 76 是不是11公和颜宁在结晶Ago蛋白质，看看C-末端是不是在内部，然后同时结晶韩春雨
的Tag-Ago。
看看带Tag的Ago会不会形成有活性的结构？ |
g******r
发帖数: 204 | 77 很多时候单根据结构无法判断活性。相当多的处在inactive和active状态的蛋白不存在
结构上的显著差异。 |
P****R
发帖数: 22479 | 78 先看看带着hisTag的Ago能否正确将C-端正位。
【在 g******r 的大作中提到】
: 很多时候单根据结构无法判断活性。相当多的处在inactive和active状态的蛋白不存在
: 结构上的显著差异。
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P****R
发帖数: 22479 | |
c********n
发帖数: 225 | 80 蛋白比较复杂，有时候真是需要去做各种尝试，才能知道它对各种条件的喜好。
从经典的生化实验中，我们可以看到，对于一个蛋白，特别是一个酶，一定要有非常好
的，稳定性，重复性都很高的assay，才能真正地了解它的功能与特性。
每个好的assay，都是酶的真实功能的显示。
如果一个酶缺乏一个assay想要测到的功能，不是assay没设对，就很可能是这个酶没有
这个想要达到的功能了。
比如Taq酶，其实它的一个很好的assay，也是它的应用，就是PCR。
这个assay 很robust， 成功率很高，应用就广了。
Taq酶辅助了PCR， PCR成就了Taq酶;
Cas9这个酶也是相似的，加上 CRISPR成为一个系统，CRISPR/Cas9也有一个很好的
assay， 也是它的应用， 这就是基因编辑了。
这个assay 也很robust， 成功率也很高，应用就更广了。
CRISPR/Cas9辅助了基因编辑，基因编辑也成就了CRISPR/Cas9
从现在这么高的不可重复的几率来看，韩春雨的NgAgo/gDNA,用基因编辑的assay来测量
，无法测到基因编辑的功能，更别谈robust和重复性了。
用基因编辑的assay测不出来，那么韩春雨的NgAgo/gDNA有没有基因编辑的功能，就要
被打上一个大大的大问号了。 |
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P****R
发帖数: 22479 | 81 分析到位。
【在 c********n 的大作中提到】
: 蛋白比较复杂，有时候真是需要去做各种尝试，才能知道它对各种条件的喜好。
: 从经典的生化实验中，我们可以看到，对于一个蛋白，特别是一个酶，一定要有非常好
: 的，稳定性，重复性都很高的assay，才能真正地了解它的功能与特性。
: 每个好的assay，都是酶的真实功能的显示。
: 如果一个酶缺乏一个assay想要测到的功能，不是assay没设对，就很可能是这个酶没有
: 这个想要达到的功能了。
: 比如Taq酶，其实它的一个很好的assay，也是它的应用，就是PCR。
: 这个assay 很robust， 成功率很高，应用就广了。
: Taq酶辅助了PCR， PCR成就了Taq酶;
: Cas9这个酶也是相似的，加上 CRISPR成为一个系统，CRISPR/Cas9也有一个很好的
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P****R
发帖数: 22479 | |
P****R
发帖数: 22479 | |
H***0
发帖数: 27 | 84 顶....................... |
