c********y
发帖数: 22 | 1 要从基因组里扩两段片段，分别也就1kb左右，居然死活p不出来，求助
引物分别都设计了3对了，taq酶p，刚开始是p不出来，后来调整体系后会在300-500这
个区域出现非常特异的条带，但是1kb的位置什么都没有
基因组pcr不是应该很多非特异性条带的么。。。
求帮分析原因。。。 |
T*****e
发帖数: 247 | 2 模板有问题吗？模板质量，模板浓度都会影响，可能你要稀释模板试试
引物GC含量多少？三对不同引物差别是什么？同一对引物你blast了吗？ |
i**********a
发帖数: 1402 | 3 genomic dna pcr的时候浓度不能太高，多稀释一下，引物3'端以g或c结尾。我做一般
用kod酶，现在谁还用taq。
【在 c********y 的大作中提到】
: 要从基因组里扩两段片段，分别也就1kb左右，居然死活p不出来，求助
: 引物分别都设计了3对了，taq酶p，刚开始是p不出来，后来调整体系后会在300-500这
: 个区域出现非常特异的条带，但是1kb的位置什么都没有
: 基因组pcr不是应该很多非特异性条带的么。。。
: 求帮分析原因。。。
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M******g
发帖数: 152 | 4 Use Q5 from NEB.
or try to purify your genomic DNA and then do PCR again. |
c********y
发帖数: 22 | 5 模版每个体系加40ug，刚开始我确实加太多了，在1kb那里有条带就以为是目的条带，
还一本正经割胶回收连接，后来才意识到可能是基因组dna而已，现在gapdh扩得很好
引物gc含量基本都在50-60之间我觉得可以接受吧，引物blast过，都有15个碱基错配，
可是我的目的片段就那么长，能设计的都设计了，再设计就不是那块区域了
【在 T*****e 的大作中提到】
: 模板有问题吗？模板质量，模板浓度都会影响，可能你要稀释模板试试
: 引物GC含量多少？三对不同引物差别是什么？同一对引物你blast了吗？
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c********y
发帖数: 22 | 6 以前我也用kod，后来觉得taq扩增效率高，先把条件摸出来再换高保真，现在新到的实
验室没有kod也是一个问题。。。关键是taq连目的片段都p不出来我总觉得换酶也不见
得有用。。。
现在模版稀释了，40ng一个体系，引物3‘端也都是g或者c
【在 i**********a 的大作中提到】
: genomic dna pcr的时候浓度不能太高，多稀释一下，引物3'端以g或c结尾。我做一般
: 用kod酶，现在谁还用taq。
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c********y
发帖数: 22 | 7 dna重新提过了，用试剂盒提的，感觉应该还好吧，gapdh扩得挺好的。
我试试，不停重新定酶怕老板批啊。。。
【在 M******g 的大作中提到】
: Use Q5 from NEB.
: or try to purify your genomic DNA and then do PCR again.
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j****n
发帖数: 3370 | 8 不同的酶最优条件是不一样的。。。
我们做pcr优化顺序
1 touch down pcr
2 gradient pcr
3 换buffer 推荐epicenter buffer kit 有12 种不同buffer 适合不同gc含量的
对于特别难P的 我们经常发现只有1-2个buffer可行
4 换酶 我们实验室全部都是用q5 除了colony pcr 所以一般换酶不会有太好结果 以前
也试过不同公司的 感觉都不如q5
【在 c********y 的大作中提到】
: 以前我也用kod，后来觉得taq扩增效率高，先把条件摸出来再换高保真，现在新到的实
: 验室没有kod也是一个问题。。。关键是taq连目的片段都p不出来我总觉得换酶也不见
: 得有用。。。
: 现在模版稀释了，40ng一个体系，引物3‘端也都是g或者c
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T*****e
发帖数: 247 | 9 我建议你用q5，如果你有的话。
模板我建议你同时用1倍，10倍稀释，100倍稀释，1000倍稀释同时做。
你说的15个错配是什么情况？一共多长？怎么会这样？如果你引物设计有困难，建议用
巢式PCR
麻烦一点的就是设计个2~3kb好扩增的，然后做成plasmid，再从里面扩增你要的1kb，
应该容易很多
退货温度也可以优化一下，不过如果是Q5，我都用NEB Tm calculator
记得NEB有个high GC的buffer 不过我从来没有遇到过那样的问题 |
n**u
发帖数: 87 | 10 1kb 左右？ 合成吧 也就五天就合好了
：要从基因组里扩两段片段，分别也就1kb左右，居然死活p不出来，求助
：引物分别都设计了3对了，taq酶p，刚开始是p不出来，后来调整体系后会在300-500这 |
s******s
发帖数: 13035 | 11 debug 的话，我一般都属先gradient pcr, 不行的话nested 基本能搞定。可能要换一
两个酶试试。
不过就一k，还不如合成，或者买clone从plasmid里面p
【在 c********y 的大作中提到】
: 要从基因组里扩两段片段，分别也就1kb左右，居然死活p不出来，求助
: 引物分别都设计了3对了，taq酶p，刚开始是p不出来，后来调整体系后会在300-500这
: 个区域出现非常特异的条带，但是1kb的位置什么都没有
: 基因组pcr不是应该很多非特异性条带的么。。。
: 求帮分析原因。。。
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l********e
发帖数: 415 | 12 问得太笼统。直接把你的序列都放出来，别人才有可能帮你。
否则都是扯淡。
【在 c********y 的大作中提到】
: 要从基因组里扩两段片段，分别也就1kb左右，居然死活p不出来，求助
: 引物分别都设计了3对了，taq酶p，刚开始是p不出来，后来调整体系后会在300-500这
: 个区域出现非常特异的条带，但是1kb的位置什么都没有
: 基因组pcr不是应该很多非特异性条带的么。。。
: 求帮分析原因。。。
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