F*K
发帖数: 608 | 1 用PCR做点突变受质粒长度限制吗？
以前做7kb(基因＋载体）点突变很容易
但最近做一个10kb的质粒突变一直不成功。 |
c**a
发帖数: 185 | 2 用TurboPfu吗？20k都没问题
94˚C 3min
16cycles : 94˚C 1min
52˚C 1min
68˚C 1min/kb/pfx; 2min/kb/pfu
68˚C 1hr |
a***o
发帖数: 129 | 3 如果旁边有好用的酶切位点，作个overlapping PCR都不用作太长的，
http://www.biotechniques.com/BiotechniquesJournal/2004/March/Ve
【在 F*K 的大作中提到】
: 用PCR做点突变受质粒长度限制吗？
: 以前做7kb(基因＋载体）点突变很容易
: 但最近做一个10kb的质粒突变一直不成功。
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F*K
发帖数: 608 | 4 多谢楼上2位！
【在 a***o 的大作中提到】
: 如果旁边有好用的酶切位点，作个overlapping PCR都不用作太长的，
: http://www.biotechniques.com/BiotechniquesJournal/2004/March/Ve
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b******n
发帖数: 4225 | 5 做过10kb的质粒点突变，赶进度做得不算很精细
土法上马
自己买的PfuUltra II HotStart Fusion DNA Polymerase(stratagene)和DpnI（NEB）
6个clone中2个成功突变了
【在 F*K 的大作中提到】
: 用PCR做点突变受质粒长度限制吗？
: 以前做7kb(基因＋载体）点突变很容易
: 但最近做一个10kb的质粒突变一直不成功。
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b**********8
发帖数: 349 | 6 借这个帖子问一下，用PfuUltra II HotStart Fusion DNA Polymerase(stratagene)和
DpnI（NEB），最多一次可以同时变几个碱基，因为自己要做一个shRNA resisitant
expression plasmid，需要每隔两个bp变一个，总共变4个，能否一次完成？还是要分
两步进行？ |
c**a
发帖数: 185 | 7 用用TurboPfu吧，每隔两个bp变一个，总共变6个都没问题。 |
b******n
发帖数: 4225 | 8 我觉得应该没问题，关键是引物设计要合适
你这4个总共才8bp，就算全突变了也不是什么大事
关键还是要引物
【在 b**********8 的大作中提到】
: 借这个帖子问一下，用PfuUltra II HotStart Fusion DNA Polymerase(stratagene)和
: DpnI（NEB），最多一次可以同时变几个碱基，因为自己要做一个shRNA resisitant
: expression plasmid，需要每隔两个bp变一个，总共变4个，能否一次完成？还是要分
: 两步进行？
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w******x
发帖数: 252 | 9 TurboPfu 和 novagen KOD HOT Start 哪个比较好呢？ 请问
【在 c**a 的大作中提到】
: 用TurboPfu吗？20k都没问题
: 94˚C 3min
: 16cycles : 94˚C 1min
: 52˚C 1min
: 68˚C 1min/kb/pfx; 2min/kb/pfu
: 68˚C 1hr
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