n*****l 发帖数: 868 | 1 实验室新项目,我真是两眼一抹黑,周围也找不到可以指导的人.
1.probe是不是就合成目的基因互补的一段单链DNA或者RNA? DNA好还是RNA好
呢?
2.probe的label是自己用试剂盒做么?看到很多人做地高辛标记,但是我们实验室要做
FISH,荧光标记是自己标还是公司可以合成? 如果有好的公司,可否给个链接,谢谢.
3.section是冰冻的好还是石蜡的好?要不要蛋白酶K处理?
真的是请前辈不吝赐教,在下不胜感激! | n*****l 发帖数: 868 | 2 还有一个问题,这个probo的长度多少合适?是不是要跨内含子?谢谢 | x**e 发帖数: 163 | 3 1.probe是不是就合成目的基因互补的一段单链DNA或者RNA? DNA好还是RNA好
呢?
是的,我们一般都用cRNA做探针。
2.probe的label是自己用试剂盒做么?看到很多人做地高辛标记,但是我们实验室要做
FISH,荧光标记是自己标还是公司可以合成? 如果有好的公司,可否给个链接,谢谢.
没做过FISH,不过做FISH的探针要考虑荧光的强度,很多公司,比如IDT,可以合成,
但只能在5‘末端加一个荧光基团,强度可能不够,自己合成的话可以将所有的U的添加
一个荧光基团,荧光强度要大数十倍。
3.section是冰冻的好还是石蜡的好?要不要蛋白酶K处理?
我做的都是石蜡的,必须要蛋白酶K处理。
探针在100bp左右为佳,是否跨内含子不清楚,我的没有跨过。 | n*****l 发帖数: 868 | 4 谢谢您的回复。
我也是看到说probe要100bp左右。但是也找到一个公司,EXIQON,online的软件给的
probe都只有20bp多,也只能带1个或者2个荧光基团.
想请教如果自己合成,是象合成引物那样,给序列公司合成后,自己用试剂盒label荧
光么?
还有就是你们为什么用石蜡的呢?他比冰冻切片更好么?因为以前我们做免疫荧光基本
都是用冰冻的,觉得石蜡步骤繁多,又爱脱片。
谢谢
【在 x**e 的大作中提到】 : 1.probe是不是就合成目的基因互补的一段单链DNA或者RNA? DNA好还是RNA好 : 呢? : 是的,我们一般都用cRNA做探针。 : 2.probe的label是自己用试剂盒做么?看到很多人做地高辛标记,但是我们实验室要做 : FISH,荧光标记是自己标还是公司可以合成? 如果有好的公司,可否给个链接,谢谢. : 没做过FISH,不过做FISH的探针要考虑荧光的强度,很多公司,比如IDT,可以合成, : 但只能在5‘末端加一个荧光基团,强度可能不够,自己合成的话可以将所有的U的添加 : 一个荧光基团,荧光强度要大数十倍。 : 3.section是冰冻的好还是石蜡的好?要不要蛋白酶K处理? : 我做的都是石蜡的,必须要蛋白酶K处理。
| c******r 发帖数: 3778 | 5 这个current protocols应该有现成的protocol吧?
【在 n*****l 的大作中提到】 : 实验室新项目,我真是两眼一抹黑,周围也找不到可以指导的人. : 1.probe是不是就合成目的基因互补的一段单链DNA或者RNA? DNA好还是RNA好 : 呢? : 2.probe的label是自己用试剂盒做么?看到很多人做地高辛标记,但是我们实验室要做 : FISH,荧光标记是自己标还是公司可以合成? 如果有好的公司,可否给个链接,谢谢. : 3.section是冰冻的好还是石蜡的好?要不要蛋白酶K处理? : 真的是请前辈不吝赐教,在下不胜感激!
| n*****l 发帖数: 868 | 6 我有protocol, 只是很多细节的东西,希望能得到前辈的真传少走弯路.
【在 c******r 的大作中提到】 : 这个current protocols应该有现成的protocol吧?
| n****x 发帖数: 11 | 7 试试这个,领域内最好的ISH技术:
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【在 n*****l 的大作中提到】 : 实验室新项目,我真是两眼一抹黑,周围也找不到可以指导的人. : 1.probe是不是就合成目的基因互补的一段单链DNA或者RNA? DNA好还是RNA好 : 呢? : 2.probe的label是自己用试剂盒做么?看到很多人做地高辛标记,但是我们实验室要做 : FISH,荧光标记是自己标还是公司可以合成? 如果有好的公司,可否给个链接,谢谢. : 3.section是冰冻的好还是石蜡的好?要不要蛋白酶K处理? : 真的是请前辈不吝赐教,在下不胜感激!
| g*****n 发帖数: 250 | 8 1. cRNA
2. 500-1000
3. DIG. Anti-DiG antibody-FTLC
4. Probe to 3' region of target mRNA, avoid conserved seq as much as
possible.
5. Paraffin sections good morph, low signal. Frozen bad morph high signal.
6. Protease K yes. But be careful, sections can fall off. | n*****l 发帖数: 868 | 9 Thank you so much!
【在 g*****n 的大作中提到】 : 1. cRNA : 2. 500-1000 : 3. DIG. Anti-DiG antibody-FTLC : 4. Probe to 3' region of target mRNA, avoid conserved seq as much as : possible. : 5. Paraffin sections good morph, low signal. Frozen bad morph high signal. : 6. Protease K yes. But be careful, sections can fall off.
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