m****m
发帖数: 395 | 1 想看看提纯后的蛋白里有没有杂蛋白，请问10孔12%的SDSPAGE胶，每孔应该上样多少ug
呢？
（我知道一个孔最多上20ul，这样的话我是把蛋白稀释一点成20ul后上样好呢？还是不
要太稀释上5-10ul就好了？）先告诉我上多少 UG 蛋白吧，目的是看纯度，是不是该多
上点，但是又不希望太多，难看又影响分辨率还不容易分开。谢谢指教！ |
h******y
发帖数: 1374 | 2 loading volume should depend on the thickness of the gel, right?
ug
【在 m****m 的大作中提到】
: 想看看提纯后的蛋白里有没有杂蛋白，请问10孔12%的SDSPAGE胶，每孔应该上样多少ug
: 呢？
: （我知道一个孔最多上20ul，这样的话我是把蛋白稀释一点成20ul后上样好呢？还是不
: 要太稀释上5-10ul就好了？）先告诉我上多少 UG 蛋白吧，目的是看纯度，是不是该多
: 上点，但是又不希望太多，难看又影响分辨率还不容易分开。谢谢指教！
|
e****s
发帖数: 1125 | 3 一般是5ug左右就好了，和体积没啥关系。
ug
【在 m****m 的大作中提到】
: 想看看提纯后的蛋白里有没有杂蛋白，请问10孔12%的SDSPAGE胶，每孔应该上样多少ug
: 呢？
: （我知道一个孔最多上20ul，这样的话我是把蛋白稀释一点成20ul后上样好呢？还是不
: 要太稀释上5-10ul就好了？）先告诉我上多少 UG 蛋白吧，目的是看纯度，是不是该多
: 上点，但是又不希望太多，难看又影响分辨率还不容易分开。谢谢指教！
|
s****l
发帖数: 395 | 4 这问题太tricky了,我以前都load好多(20ug),可以看到很多杂拌,但是主band太明显了(
已经饱和了),结果被committee批评说提蛋白水平太差,蛋白太不纯.
结果我就老实了,按照paper上别人load的强度,同样的sample,我load 1ug后就剩下1条
主band,然后大家都很开心的说蛋白很纯一条带. 所以我觉得最好做个梯度, 从0.5ug到
20ug, 自己清楚一个purity,给别人show另一个purity.
ug
【在 m****m 的大作中提到】
: 想看看提纯后的蛋白里有没有杂蛋白，请问10孔12%的SDSPAGE胶，每孔应该上样多少ug
: 呢？
: （我知道一个孔最多上20ul，这样的话我是把蛋白稀释一点成20ul后上样好呢？还是不
: 要太稀释上5-10ul就好了？）先告诉我上多少 UG 蛋白吧，目的是看纯度，是不是该多
: 上点，但是又不希望太多，难看又影响分辨率还不容易分开。谢谢指教！
|
m****m
发帖数: 395 | 5 说得有理。但是我现在得对自己负责，我提纯了要测结构的，所以一定要看到杂的是不
是多。但是不是总是不可能100%纯呢？
了(
【在 s****l 的大作中提到】
: 这问题太tricky了,我以前都load好多(20ug),可以看到很多杂拌,但是主band太明显了(
: 已经饱和了),结果被committee批评说提蛋白水平太差,蛋白太不纯.
: 结果我就老实了,按照paper上别人load的强度,同样的sample,我load 1ug后就剩下1条
: 主band,然后大家都很开心的说蛋白很纯一条带. 所以我觉得最好做个梯度, 从0.5ug到
: 20ug, 自己清楚一个purity,给别人show另一个purity.
:
: ug
|
W*********e
发帖数: 247 | 6 你这种情况上样多点没啥坏处啊, 难道担心你的蛋白和杂蛋白在胶上分不开?
【在 m****m 的大作中提到】
: 说得有理。但是我现在得对自己负责，我提纯了要测结构的，所以一定要看到杂的是不
: 是多。但是不是总是不可能100%纯呢？
:
: 了(
|
p******i
发帖数: 1092 | 7 貌似可以切膠再去測MS？
【在 m****m 的大作中提到】
: 说得有理。但是我现在得对自己负责，我提纯了要测结构的，所以一定要看到杂的是不
: 是多。但是不是总是不可能100%纯呢？
:
: 了(
|
a***a
发帖数: 40617 | 8 initial screening 90% purity就可以
一般commassie blue stain肉眼能看到的量大概是0.5ug
换句话说你至少要load 5ug以上
你送去给人做结构的样品一般至少要浓缩到10mg/ml以上
跑1ul样品就可以了，根本不用考虑上样体积
【在 m****m 的大作中提到】
: 说得有理。但是我现在得对自己负责，我提纯了要测结构的，所以一定要看到杂的是不
: 是多。但是不是总是不可能100%纯呢？
:
: 了(
|
m****m
发帖数: 395 | 9 可以，但是LAB MANAGER不同意，说耗费用
【在 p******i 的大作中提到】
: 貌似可以切膠再去測MS？
|
n****e
发帖数: 1677 | 10 晶体结构？还是光谱之类的？蛋白哪有100%纯的，多load点肯定会看到杂带，即使少
load,也可以用不同的染色法看到杂带，比如silver stain.
【在 m****m 的大作中提到】
: 说得有理。但是我现在得对自己负责，我提纯了要测结构的，所以一定要看到杂的是不
: 是多。但是不是总是不可能100%纯呢？
:
: 了(
|
j*********n
发帖数: 168 | 11 如果对蛋白的纯度还没准确测量，那就分别上5、10、15（加了loading buffer）后的
，大致估一下，下次照此办理……
细胞裂解的上清，杂蛋白比较多，可以稍微少上点样；经过凝胶柱或者离子交换提纯的
，要少上些……
跟做菜一样，放多少盐，你自己嘴巴尝尝就有数了……
当然，你得先会做菜。
你问的好几个蛋白分离，检查的问题都很入门啊，不是入错了行吧…… |
