m****m
发帖数: 395 | 1 想看看提纯后的蛋白里有没有杂蛋白，请问10孔12%的SDSPAGE胶，每孔应该上样多少ug
呢？
（我知道一个孔最多上20ul，这样的话我是把蛋白稀释一点成20ul后上样好呢？还是不
要太稀释上5-10ul就好了？）先告诉我上多少 UG 蛋白吧，目的是看纯度，是不是该多
上点，但是又不希望太多，难看又影响分辨率还不容易分开。谢谢指教！ |
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m****m
发帖数: 395 | 2 我每次做SDSPAGE胶都很紧张，尽管动作已经非常快了，7.94ML的分离胶溶液要一次性
同时做完两块胶，就是做不好，做一块我还行。分离胶的水平线总是不平整。
下面是我的配方，大家看看哦
1.9ML 49.5% AABis
2.67ml buffer (3M tris,0.3%SDS,PH8.5)
2.67ml glycerol:H20(56:44)
0.7ML H20
APS(10%) 80ul
TEMED 16ul(后来因为凝太快改成了13ul，还是来不及)
（这个分离胶水封后，我看基本5分钟多点就完全凝住了）
首先，溶液我肯定仔细混匀了，然后我用这点溶液分别加到两块胶板的刻度线上，加完
一块，加另一块，基本正好用完这点，期间动作非常快的。然后轻轻地加水，为了使其
平整，因为要加两块，总是让其中一块要等一会，加水的时候我不敢用力，因为会让胶
起伏造成不平整，也是按先前的顺序加先注胶的那块，然后再给另一块加水。但是不知
道为什么就是掌握不好，做到最后两块都不是很平整，要不就是大波浪型，要不就是虽
然直了但是是斜的，觉得还是加水的时候胶已经开始凝了。
为了做好 |
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s*******e
发帖数: 1010 | 3 MS还是SDSPAGE鉴定的分子量？SDSPAGE跑蛋白分子量本来就不准的。 |
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h******y
发帖数: 1374 | 4 loading volume should depend on the thickness of the gel, right?
ug |
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s****l
发帖数: 395 | 6 这问题太tricky了,我以前都load好多(20ug),可以看到很多杂拌,但是主band太明显了(
已经饱和了),结果被committee批评说提蛋白水平太差,蛋白太不纯.
结果我就老实了,按照paper上别人load的强度,同样的sample,我load 1ug后就剩下1条
主band,然后大家都很开心的说蛋白很纯一条带. 所以我觉得最好做个梯度, 从0.5ug到
20ug, 自己清楚一个purity,给别人show另一个purity.
ug |
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m****m
发帖数: 395 | 7 说得有理。但是我现在得对自己负责，我提纯了要测结构的，所以一定要看到杂的是不
是多。但是不是总是不可能100%纯呢？
了( |
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W*********e
发帖数: 247 | 8 你这种情况上样多点没啥坏处啊, 难道担心你的蛋白和杂蛋白在胶上分不开? |
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a***a
发帖数: 40617 | 10 initial screening 90% purity就可以
一般commassie blue stain肉眼能看到的量大概是0.5ug
换句话说你至少要load 5ug以上
你送去给人做结构的样品一般至少要浓缩到10mg/ml以上
跑1ul样品就可以了，根本不用考虑上样体积 |
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m****m
发帖数: 395 | 11 可以，但是LAB MANAGER不同意，说耗费用 |
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n****e
发帖数: 1677 | 12 晶体结构？还是光谱之类的？蛋白哪有100%纯的，多load点肯定会看到杂带，即使少
load,也可以用不同的染色法看到杂带，比如silver stain. |
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j*********n
发帖数: 168 | 13 如果对蛋白的纯度还没准确测量，那就分别上5、10、15（加了loading buffer）后的
，大致估一下，下次照此办理……
细胞裂解的上清，杂蛋白比较多，可以稍微少上点样；经过凝胶柱或者离子交换提纯的
，要少上些……
跟做菜一样，放多少盐，你自己嘴巴尝尝就有数了……
当然，你得先会做菜。
你问的好几个蛋白分离，检查的问题都很入门啊，不是入错了行吧…… |
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m****m
发帖数: 395 | 14 歪的胶跑出来的条带就不可信了，所以我一定要做好。
但是我不想每次一做胶就很紧张，可不可以从容地、对速度要求不那么高的情况下做完
啊？
配方要怎么改一下吗？ |
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p*3
发帖数: 45 | 15 8ul TEMED for 8ml gel is more than enough |
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a********k
发帖数: 2273 | 16 你的id真工整，让我觉得是my mm yammy的缩写 |
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m****m
发帖数: 395 | 18 ^_^ 我是女生啦。这个只是我名字首字母的缩写，重复，而已。别歪楼 |
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a***a
发帖数: 40617 | 21 aps 80ul
temed 8ul
足够了
你这个16ul改13ul太鸵鸟了。。。 |
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a****o
发帖数: 1786 | 22 我碰到这种问题，肯定APS，TEMED各减半先
我以前都用异丙醇压平 |
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y***k
发帖数: 60 | 23 temed用量减半
如果胶还是不平，可以改用乙醇封 |
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p******i
发帖数: 1092 | 25 amedio說的沒錯，肯定APS，TEMED各减半先……不過可能要等很長時間……
我用0.1%SDS封膠的，就是在兩邊各加一點就好了…… |
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M*****n
发帖数: 16729 | 28 如果是每天跑十几块胶的，买现成的恐怕很费钱哦，除非大老板，小老板负担不起的。
如果每天一两块胶，还是买现成划算。你每小时的人工就超过一块胶了。 |
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W****C
发帖数: 1937 | 29
从来没听说过用乙醇封的。。。。挥发了吧。。。。用水封多简单啊 |
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h********n
发帖数: 4079 | 31 买胶, 一定要买.
自从我用上买的胶, western水平大大提高, 哇咔咔咔咔 |
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a***a
发帖数: 40617 | 33 ft。。。现在都这么二把刀吗？
先搞清楚为啥要封 |
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l*****o
发帖数: 26631 | 35 我就是用乙醇封的， 下面胶凝了以后把乙醇倒掉，吸干，微量残留的还能挥发掉，挺
好啊。 |
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j*********n
发帖数: 168 | 36 呵呵，用水能封住么？
你配的胶液里没水么？
有水的话，此水和彼水有什么差别么？
我在国内用异丙醇封胶，只加一点，略微能盖过分离胶就好。等加浓缩胶的时候，把异
丙醇倒掉，用蒸馏水冲洗一下，干了就可以加浓缩胶了。
在美国实验室，直接用100%乙醇封，就直接用洗瓶加满，也是等分离胶凝固了，倒掉乙
醇，挥发干净了再加浓缩胶。
凝得快肯定是他妈的（TEMED)加多了，我先后做过DGGE，SDS-PAGE，Urea PAGE,AP的量不是很重要，主要还是他妈的。
你试试减一下量，应该能解决。
又及：查了一下实验室protocol，我们一次配4 pieces，20ML胶液，加了8UL他妈的。
或者你可以参考一下比例。一般不到半小时就可以凝胶了…… |
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T**********t
发帖数: 1604 | 41 我配10ml的胶只用4ul的TEMED就够了。
上面用水饱和的正丁醇封。
APS一定要新鲜配，我发现哪怕是放-20度保存的APS也没有新鲜配的好用。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 42 用水/乙醇/异丙醇封胶都可能会使分离胶表面的局部胶浓度发生变化。水饱和的正丁醇
因为不能够再吸收水分，所以应该是最适合封胶用的。不过我也用水封过胶，貌似没看
出太大影响。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 43 用水能封住。
我用水封了好几年的胶都没问题呢。最近rp有点低落，胶表面也偶然出现不太工整的情
况，才重新开始用水饱和正丁醇封的。
封胶就是为了隔绝空气嘛。混好的胶溶液的密度比水大很多，只要加水的时候小心一点
，不至于混得太厉害，分层还是很明显的。
量不是很重要，主要还是他妈的。 |
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a***e
发帖数: 1010 | 44 APS solution can be stored at 4oC for 1 month. |
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T**********t
发帖数: 1604 | 45 我以前是分装了放-20。
有时候忘记收起来，放室温一个礼拜，偷懒拿来直接用也没关系。
但是每次rp不好胶凝得难看了一点的时候，新鲜配的APS总是好过冰箱里拿出来的。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 46 前两条赞同
APS新不新鲜没关系，越新鲜凝得越快
我们以前实验室APS配好了放室温都能用一个月
就是慢一点 |
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k****o
发帖数: 589 | 47 减少APS或者TEMED的量，自己把握。用水，丁醇，乙醇，异丙醇封都行。APS无所谓，
我放三个多月了照样用得开心。做胶的时候没什么好紧张的，不好重新灌就是了，便宜
。只是注意千万不要沾有害物质了。一旦你灌习惯了，反而不喜欢用现成的胶。我用自
己的胶跑出来的效果比直接买的好不少。 |
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y****2
发帖数: 1601 | 49 把所有溶液都放4C储存，这样凝的就不会那么快了 |
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a****d
发帖数: 1919 | 50 来这边后从来没配过胶，都忘了。。。
偶用的是invitrogen的预制胶，效果挺好的 |
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