v********a
发帖数: 646 | 1 把不同的蛋白样品定量后，load相同量的蛋白样品做Western Blotting，但是出来结果
，总是出现loading control 的量并不一致，有的多，有的少。非常苦恼。
请问：如何能作出loading control 一致的Western Blotting？
知道这个问题很low，但乡下人就是这么菜。恳请达人指教诀窍：怎样处理组织或者细
胞样品，从而使SDS-PAGE上样量一致？谢谢。
我的方法：
细胞或组织用RIPA裂解
超声3次，15s on/15s off
离心12000rpm，取上清
将上清做2x梯度稀释，然后用bca kit测定浓度
取相同量的蛋白跑page
转膜，wb |
c******o
发帖数: 9 | 2 不同批次处理的样品不建议在同一块胶上比较。
把想要比较的样品重新处理，bca，再上样 wb. |
l*****7
发帖数: 8463 | 3 关键是要控制好蛋白质定量，盐浓度，buffer浓度和pH,
不同时间采集的样品也要在同一次蛋白定量,
调节跑胶的电压，电压越高，跑的越快，bands越sharp。 |
t***l
发帖数: 335 | 4 你是只要loading control一致对不对？
我以前会先跑一个胶，根据这个跑出来的loading control调整上样量。用loading
buffer调整到相同的vol 然后再跑一次就可以了。。 |
m****a
发帖数: 270 | 5 什么原理？我怎么听说是电压低，跑得条带窄？
【在 l*****7 的大作中提到】
: 关键是要控制好蛋白质定量，盐浓度，buffer浓度和pH,
: 不同时间采集的样品也要在同一次蛋白定量,
: 调节跑胶的电压，电压越高，跑的越快，bands越sharp。
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l*****7
发帖数: 8463 | 6 主要是跑的快，减少了diffusion吧。
适当的点压，band不会变窄的。
其实loading非常简单：
如果用同一条件提取蛋白,
以最低蛋白浓度的样品为基准，用等量的loading buffer(2x loading buffer)，再用
auto cleaved ddH2O (当然你也可以用你的protein样品的buffer)调节其它样品的走胶
液总量。每个lane加入等容量，等蛋白的走胶液。
比如你要load 10 μl（10 μg 蛋白）走胶液，你就要配15－20 μl 的走胶液。
我跑的蛋白胶做western都是直线状或很细的直带状，偶尔会像新月状
这都是几十年前的老方法啦。
我作时， 基本只load 2.5－5 μg总蛋白(混合蛋白, 比如从细胞提取的,或细胞核提取
的）／lane, 你若用纯的， 单一蛋白，用量要减很多。
【在 m****a 的大作中提到】
: 什么原理？我怎么听说是电压低，跑得条带窄？
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