S*******e
发帖数: 17 | 1 电镜差不多有一百年,最初的模型仅能放大几倍,但现在已经可以看清硅晶体里的原子束
了.冷冻电镜约有二十年的历史,是为观察蛋白活性状态发展出来,之前大家用重金属盐
染色法样品严重失水变形, 而且看到的图象实际是密度大的盐包围蛋白形成的轮廓,分
辨率限制在20-30A样子. 应用液态乙烷速冻蛋白溶液可使样品被包埋在密度低的玻璃态
冰里从而突显密度稍高的蛋白质,因后者密度仅是前者的1.5倍不到样品信号基本上被掩
埋在噪音里,因此这技术适用于大蛋白复合物,目前下限大概在200-300KDA.
电镜结构重组涉及到很多图象处理,最重要的技术是通过复合大量单颗粒图象来提高信
噪比,这里隐含的前提是所有单颗粒有同样的组成同样的构象.实际上生物分子总处于动
态的变化中,因此就有上面有人提到的不均一性问题.少数例外是有高对称性的病毒颗粒
(UCLA的ZHENHONG ZHOU实验室发表了几个3.5A左右的病毒结构),和其他一些对称性较高
的分子(BEYLOR的WHA QIU实验室做的4A的GroEL,BERKELEY的EVA实验室有一些微管蛋白
的精细结构).其他对称性不高的蛋白分辨率局限在10A上下(例外 |
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W*********e
发帖数: 247 | 2 会影响蛋白的稳定性或者能否形成复合物
Tris是buffer, 不同的pH也会影响蛋白的稳定性和溶解度 |
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w******y
发帖数: 8040 | 3 syg也不能说就不对， 无非夸大作用而已
一般来说， 公司里是否结晶target和lead的复合物用于
随后的修饰改造， 主要是个成本控制
因为有经验的化学家看lead结构就能给出很多改造的clue
结晶不过是提供更多更强的clue而已
但值不值得为此花功夫结晶， 是个成本控制问题了
总之， 结构生物学在药物开发中的作用还是很辅助的
什么时候virtual screening真牛了， 才是structural biology在药物
发现上做大贡献的时候
藏] |
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w******y
发帖数: 8040 | 4 1. 各种低等模式生物的specific gene/pathway研究，
但通过systems biology研究general design principle的除外
2. 结构生物学去研究所谓的分子精细结构，
但开发结构生物学方法的， 以及结晶target-lead复合物的除外
3. 水稻/熊猫基因组测序， 但 resequencing on human cohorts和诊断测序除外
这些基础研究对科学来说有其重要性， 但离应用价值距离太远，
重金投入非常不明智, 保持小规模精兵足够了 |
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n***g
发帖数: 512 | 5 这个还真不好说，单个蛋白的结构都解出来了，还可以解多个蛋白复合物的结构，蛋白
和化合物的结构等待，基本上是无限多的组合。
JBC |
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C*******e
发帖数: 4348 | 6 不知道invitrogen的blue native gel是怎么一回事
可是如果搜文献出来的blue native gel那个也是native gel啊
怎么叫和native gel两码事？
用的buffer system是不一样
可是目的都是native条件下分离蛋白复合物啊 |
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p*****m
发帖数: 7030 | 7 你说他们怎么自己闹将起来。。
http://www.ccthere.com/article/3187072
蒲慕明：中国科学“病”在何处？
徐治国
时隔两月，科技部新闻发言人终于就美国《科学》杂志刊登施一公、饶毅社论一事作出
答复，认为文中所涉中国基础研究科研经费分配问题与事实不符。这一回应于11月8日
在科技部网站刊出。
事情起因于今年9月，美国《科学》杂志刊登名为《中国的科研文化》（China's
Research Culture）的社论指出，中国现行的科研基金分配更多地是靠关系而非学术水
平高低，直接“炮轰”当前中国的科研经费分配体制及科研文化问题。文章的作者是两
位来自中国最著名学府的杰出“海归”院长——清华大学生命科学学院院长施一公教授
和北京大学生命科学学院院长饶毅教授。
随后，《科学新闻》采访了国内众多院士和知名教授，对中国科研的现状进行探讨，并
以《撬动中国科技潜规则》一文刊发（详见本刊今年第19期），引起科技界密切关注。
对于施、饶的社论，中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所所长蒲慕明持批评
态度。他在接受《科学新闻》专访时指出，两位来自中国最著名大学的年轻领军... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 8 另外啊，某些过渡性金属，还真的说不定可以作为life form basis,
因为它们可以形成稳定多键复合物。
have
.. |
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f******g
发帖数: 592 | 9 ZT 蒲慕明：中国科学“病”在何处
点评施一公饶毅《科学》社论，并呼吁中国科学家自律
作为一位在国内工作多年的外籍科学家，中科院神经科学研究所所长蒲慕明点评施一公
和饶毅发表在《科学》杂志上的社论，并呼吁中国科学家自律.
时隔两月，科技部新闻发言人终于就美国《科学》杂志刊登施一公、饶毅社论一事作出
答复，认为文中所涉中国基础研究科研经费分配问题与事实不符。这一回应于11月8日
在科技部网站刊出。
事情起因于今年9月，美国《科学》杂志刊登名为《中国的科研文化》（China's
Research Culture）的社论指出，中国现行的科研基金分配更多地是靠关系而非学术水
平高低，直接“炮轰”当前中国的科研经费分配体制及科研文化问题。文章的作者是两
位来自中国最著名学府的杰出“海归”院长——清华大学生命科学学院院长施一公教授
和北京大学生命科学学院院长饶毅教授。
随后，《科学新闻》采访了国内众多院士和知名教授，对中国科研的现状进行探讨，并
以《撬动中国科技潜规则》一文刊发，引起科技界密切关注。
对于施、饶的社论，中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所所长蒲慕明并不完
全赞同。他在接受《科... 阅读全帖 |
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t**m
发帖数: 158 | 10 我这一个小师妹也郁闷着呢:
我们和主要竞争对手关系很好, 两边进度也都差不多, 都互通声气
小师妹拼死拼活干了半年多, 也是过年都没回去, 都有单体结构以及复合物结构了, 生
化做完paper写好了. 竞争对手投CNS, 我们投子刊, 本以为是大家皆大欢喜的事.
结果上个礼拜pubmed, 单体结构被人发晶体学报了...
那种吃了苍蝇的感觉真是太爽了 |
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n***g
发帖数: 5027 | 11 这个总结不错：
申请精华帖：我了解的Epigenetics牛人一览
我是从C.D.Allis，Danny Reinberg，Tony Kouzarides，Yi Zhang， Yang Shi这几个
人发的文章看起的，这几个人基本上就是目前做表观遗传最牛的一批人了。然后你看看
他们文章citation里面出现频率比较高的人名，那往往就是大牛了，然后一点一点扩展
。个人感觉看CNS及其子刊还是王道。另外推荐一个很好的网站，http://www.epidna.com/ 可以查这个领域最top的lab，也可以查该领域最新的论文。
# ^2 P/ }, _0 h" U8 m) P6 b
; l* o$ y- |- V5 g0 I0 T然后在申请选校的过程中，我也逐渐了解到一些
epigenetics领域的big names和rising stars。所以我感觉看各个牛校的faculty也是
了解一个领域的好学校好lab的方法。我的做法是每看一个学校，就把相关领域做
epigenetics的faculty留下来，然后以后看CNS时或者Journal club上看到熟悉的名字
，就重点关注下。$ ... 阅读全帖 |
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s*********t
发帖数: 600 | 12 一公时代的到来
一公时代的到来，指的是清华大学生命科学院、中国的结构生物学史上施一公时代的到
来。借着清华大学百年校庆，这
两天在清华举办的FPS（Frontiers of Protein Sciences）会议作为醒目的标志，给大
家展示了施一公教授的能力与魅
力。一公时代的大幕朝每一个与会者闪亮的拉开。
这段话写的是如此的像托，像清华生科院给媒体的公关文，但这确实是我这次会议的切
身感受，容我一一道来。
施一公教授从2008年回清华组建实验室到现在，满打满算三年。三年对于一个挪窝的人
来说，是短暂的，结束那边的事
情，迎接这边的事情，科研上的行政上的生活上的麻烦不会少，而且还有方/舟/子对他
有理有据的质疑。这种日子肯定
不会好过，他是怎么过的，我不知道，我所知道的是我们大家都能看到的。
科研上。饶毅教授下过结论：施一公教授是华人里发表CNS文章最多的人。这指他在
Princeton的时候，回来以后呢？会
议上发的介绍里，施一公教授从09年到11年的selected publications共11篇，Cell两
篇，Nature四篇，Science一
篇，PNAS两篇，Mol ce... 阅读全帖 |
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z*t
发帖数: 863 | 13 现在不是很清楚，比如在Neuro Spora中先有H3K9me3然后有dna methylation,哺乳动物
里Dnmt3a/3b/3L形成复合物binding到H3K9me3的site然后methylate DNA,LSD1 KO会造
成defiency in imprinting, G9a KO也会造成methylation decrease
而早一点的发现dna methylation也可以招募MBD/MePG之类造成histone去乙酰化，还可
以招募H3K36的demethylase。这两者是interwine的关系,谁先谁后目前还没定论。。。 |
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z*t
发帖数: 863 | 14 现在不是很清楚，比如在Neuro Spora中先有H3K9me3然后有dna methylation,哺乳动物
里Dnmt3a/3b/3L形成复合物binding到H3K9me3的site然后methylate DNA,LSD1 KO会造
成defiency in imprinting, G9a KO也会造成methylation decrease
而早一点的发现dna methylation也可以招募MBD/MePG之类造成histone去乙酰化，还可
以招募H3K36的demethylase。这两者是interwine的关系,谁先谁后目前还没定论。。。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 15 有的问题已经在别的帖子里发过了，但是关注度不够，到现在没得到答复，现在贴到这
里归个总，大家一定要帮帮我，凡是看过这个帖子的都给我点意见吧，特别是艳阳天MM
啊，Oncogene版主啊，给点权威的意见吧，小弟先谢谢你们了
问题1，
最近做dual luciferase reporter assay，主要是想看在癌细胞中敲除某一基因A后，
对另一基因B启动子活性的影响。（已经证实敲除A后能下调B的mRNA转录和翻译表达）
。我尝试过两种不同的转染顺序，如下：
1）24 well plate铺板，第二天转染A的siRNA,第三天转染B的启动子报告基因质粒，第
四天收细胞assay，发现siControl和siA的renilla的读数相差很大，有时能达到10倍左
右，出来的ratio也经常是千奇百怪，忽高忽低，难以解释，
2）考虑到可能是先转染siRNA会影响后续质粒的转染效率。于是换方案，先在6孔板中
铺板，第二天转染质粒，过夜后换液，转染24小时候胰酶消化，将细胞铺到24孔板中，
24小时后再分别转染siControl和siA，出来的结果漂亮多了，至少data不像前一种方案
那么难看了。... 阅读全帖 |
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g*********d
发帖数: 233 | 16 RNA干扰及其在动物繁殖中的应用
2009-12-28
RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是生物进化过程中遗留下来的一种在转录后通
过 RNA 调控基因表达的机制, 它是指在真核细胞中引入双链 RNA分子从而导致具有序
列同源性的基因产生特异性基因沉默 (gene silencing)的现象 。由于 RNA干扰可以阻
断特定的基因表达, 具有超越疫苗和抗病毒药物的诸多优点, 因此在阐述基因功能以及
蛋白质相互作用等方面, 表现出诱人的前景。近年来随着分子生物学的发展, RNAi 的
机制也不断被阐明, 同时国内外研究也证实 RNAi 技术可以为动物繁殖过程中所涉及的
基因功能提供一条新的思路, 这在科研和生产实践上都具有重要的意义。
1 RNAi的发现
Matzke 等于 1989 年报道了启动子介导的序列同源性基因共转染烟草可引起转
基因表达发生沉默。 1990 年, Napoli 和 Van der Krol 等为了让矮牵牛花的颜色更
加鲜艳, 把与紫色相关的查尔酮(chalcone)基因转染到牵牛花内, 结果意外发现, 植物
体的颜色... 阅读全帖 |
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D***a
发帖数: 516 | 17 我也借机问个问题：假设说蛋白A的C末端10aa与蛋白B结合，我用的IP抗体也是识别A蛋
白C末端10aa的，那我用这个抗体能拉下来AB复合物吗？ |
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j****x
发帖数: 1704 | 18 学生化的不懂这些概念确实有点说不过去吧。。。
1） google或者wiki直接就可以解决的。
2） class II这里指的是组织相容复合物MHC/HLA的分类，免疫学基本概念
3） locus特指gene或者一段特征序列在染色体/基因组上的具体定位，例如human TP53
的locus对应在17p13.1
II |
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c*********r
发帖数: 181 | 19 高手们都放假了嘛？
我的想法是AB的复合物放上去，然后作SPR。
大家认为可行吗？ |
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S*****3
发帖数: 720 | 21 “中国百篇最具影响优秀国际学术论文” 评选所选论文代表了我国科技论文发展的最
高水平。论文源为前一年被SCI（科学引文索引）收录的中国论文。评选综合考虑发表
论文的期刊水平（影响因子和单篇引用次数）、论文类型、热点论文、论文的合作强度
、参考文献数和论文的完整性等方面。
其中生物类包括：
论文题目: Acute promyelocytic leukemia: from highly fatal to highly
curable
论文作者: Wang, Zhen-Yi; Chen, Zhu
所属机构: 上海交通大学医学院瑞金医院
来源期刊: BLOOD, 2008, 111(5):2505-2515
被引次数: 29
作者简介：
陈竺
卫生部部长，中国科学院院士，博士生导师
白血病系统生物学研究组组长
论文题目: Sorting of small RNAs into Arabidopsis argonaute complexes
is directed by the 5 ' terminal nucleotide
论... 阅读全帖 |
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C*********m
发帖数: 213 | 22 你那个蛋白如果R/K rich用高盐，低盐跑两个gel filtration，看看复合物大小有没有
变化。如果除了那几个残基其他部分有作用的话，不同盐浓度下rentation time会有变
化。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 23 非常感谢。这个链接给出的protocol很详细。但是我又有一个新的问题，在还掉含有转
染复合物的medium之后，新加入的medium中添加了抗生素，这个会对之后感染病毒的细
胞有影响吗？会不会产生很大的毒性？因为慢病毒本身的细胞毒性其实也挺明显的，如
果再加上抗生素的压力的话，感染的细胞岂不是要死光光？ |
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x***o
发帖数: 47 | 24 x是和底物催化直接相关，wt和mutant都做了，我怀疑可能是结合不紧密造成的。
酶活还没做呢，打算做呢。我想知道如果是结合底物后会造成构象变化，那我怎么确定
呢（复合物估计拿不到，看不到结合），另一个可能如果这个蛋白是酶原的话，我又该
怎么确定。谢谢大家。 |
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x***o
发帖数: 47 | 25 这个就很难泡，而且到现在也没有文章报道过和底物的复合物，单体倒是很多
SPR |
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C*******e
发帖数: 4348 | 26 SAXS可以做“living structure”的么？
学习了
你指的是切片->微结构，还是蛋白、蛋白/核酸复合物？
discovery. |
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C*******e
发帖数: 4348 | 27 SAXS可以做“living structure”的么？
学习了
你指的是切片->微结构，还是蛋白、蛋白/核酸复合物？
discovery. |
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b******e
发帖数: 88 | 28 zhou hong的3.2A都已经是很多年前的事了，主要还是得益于高对称性，即使在今天，
对于普通没有对称性的超大复合物冷冻电镜能够做到7-8A也是牛逼得一塌糊涂了，参看
一月的nature。我不觉得在将来冷冻电镜的技术可以牛逼到晶体学那么高的分辨率，当
然其他的技术突破然后淘汰晶体学那是完全有可能的。不过真到那个时候好的晶体学家
还是可以很容易的跟上潮流，只会纯化长晶体的当然就歇了。 |
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s*********t
发帖数: 600 | 29 透析和直接稀释区别何在？文献上都是透析。
比如抽提细胞系的细胞质和核蛋白纯化complex，我一直是这么做的：
harvest 细胞。加5倍细胞pellet体积的低盐溶液（20mM KCl），冰上放10分钟，用
homogenizer捣12次（用tight的B型活塞），3500 rpm离心10min，上清取出，加0.11倍
体积的1.4M KCl，使得终浓度成100mM，我看文献上说要10万g离心若干小时。可是我们这没有这
样的离心机。只能最大速度（5万G）离心1h，作为细胞质抽提物
S100，分装后液氮速冻，-80保存。这一步很难，因为不管离心多久，都有脂状物质悬浮着，得到的
是浑浊的东西。
对于pellet，加两倍体积的420mM KCl。用homogenizer捣若干下，把鼻涕状黏糊糊的东
西充分散开。然后4度摇30min-1h。然后1万2千g离心30min，分装后液氮速冻，再放-80
，作为nuclear extract。
不知道液氮速冻这一步对于防止蛋白变性有好处，还是别的原因？为何需要速冻？
如果用于蛋白复合物的纯化，我以前是用300mM的盐。但是boss让我改成250mM... 阅读全帖 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 30 还是没明白你到底要做一个蛋白，还是两个蛋白
建议你先纯化到蛋白的复合物以后再浓缩
不要浓缩以后再把两个蛋白混起来
浓缩的话大体积可以用centricon
体积小的话用minicon |
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u**********d
发帖数: 573 | 31 是小概率事件，还是特异性事件？
过两天说不定有人报告说，基因组从核孔复合物抛出一条loop到细胞质，一群RNA pol
II在那里忙得不亦乐乎。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 32 Johns Hopkins too 连tenure都过不了
不是看已有领域的挖掘 还要看新领域的digged out data and results.
please refer:
for example:
Lee Martin, Ph.D.
Professor of Pathology, Neuroscience
//pathology.jhu.edu/department/divisions/neuropathology/faculty-staff.cfm
his group recent paper:
线粒体上的控制 NO 的通道控制着细胞老化和自然死亡的过程
"The mitochondrial permeability transition pore regulates nitric oxide-
mediated apoptosis of neurons induced by target deprivation.” (2011)
J Neurosci. 31: 359-370.
PubMed link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2... 阅读全帖 |
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k******0
发帖数: 1073 | 33 SAXS好用吗？
小角度X射线散射测定蛋白质结构
22 07 2009
隶属于美国能源部的劳伦斯伯克利国家实验室的科学家开发出一种利用小角度X射
线散射技术测定蛋白质结构的新方法，大大提高了蛋白质结构研究分析的效率，使过去
需要几年时间完成的工作仅需要几天即可完成，这将极大地促进结构基因组学的研究进
程。
结构基因组学是一门研究生物中所有蛋白质结构的科学。通过对蛋白质结构的分析
，可大致了解蛋白质的功能。结构基因组学重视快速、大量的蛋白质结构测定，而快速
结构测定技术正是该学科研究面临的一个瓶颈问题。目前通常使用的两种测定技术，X
射线晶体衍射和核磁共振质谱技术，虽然精确，但速度很慢，测定一个基因的蛋白质结
构，动辄就需要几年的时间。随着新发现的蛋白质及蛋白质复合物越来越多，目前的分
析速度远远不能满足研究的需要。
为解决这个瓶颈问题，劳伦斯伯克利国家实验室的科学家们借助了该实验室的先进
光源（ALS）。他们运用一种称为小角度X射线散射（SAXS）的技术，对处于自然状态下
（如在溶液之中）的蛋白质进行成像，其分辨率大约为10埃米（1埃米等于1/10纳米）
，足够... 阅读全帖 |
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l******n
发帖数: 143 | 34 象前面同学推荐的,光谱类的快速,简单,直接.作为首选很合适.
(1).Fluorescence Emission,最简单的看看tyrosine, tryptophan的化学环境有没有因
为Mg结合而变化,从而对荧光有影响.
(2).同时可以尝试Circular Dichroism,最简单的蛋白二级结构,如果不追究变化的源头
,而只是用变化作为信号去测量金属离子和蛋白作用的,很简单方便.
以上两个方法典型的应用有很多,比如calmodulin和钙离子作用.
注意:因为你需要测的是chemical equilibrium,如果反应很慢的话,需要保证滴定过程
每个滴定点(浓度)都要达到化学反应平衡.
SPR
这个不适合,首先是因为信号来自bulk solution(流动的溶液)中的分子被吸附到固定在
表面的蛋白上形成复合物,本质上因为质量吸附造成sensor surface附近媒介的折射率
改变.所以被吸附的质量大小直接影响了信号强弱.你的实验是Mg在bulk solution,这么
小的离子,几乎不可能产生什么明显的信号.这也是ligand-protein binding里很少用
SPR的... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 35 我听说过好几次说是复合物要过clinical trial 很麻烦。到底具体是怎么回事？
的。 |
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K**4
发帖数: 1015 | 36 centrioles 相互垂直是不是由于结构需要，毕竟在没有成熟前他们需要互相支撑？
在之后的cell cycle， centrioles靠近核膜，会形成有丝分裂的纺锤体。他们靠近
cell membrane,会形成cilia。他们在成熟过程中肯定需要不同的蛋白复合物，但我觉
得不太可能二者之间有什么大的差异，毕竟功能相同。
至于疾病，由于centrosome or cilia-related 疾病很多是遗传性的，比如BBS，NPHP,
MKS，很多胎儿在怀孕期间就流产了，存活下来的也是症状太严重，药物应该没有什么
作用吧。
Have |
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l**********1
发帖数: 5204 | 37 En
Bio aspect:
兰州大学 生命科学部 畜牧学与草地科学 张金林 草类植物逆境生理
中国农业大学 生命科学部 遗传学与生物信息学 陈忠周 表观遗传学中重要蛋白质的结
构和功能研究
中国医学科学院基础医学研究所 生命科学部 遗传学与生物信息学 许琪 DTNBP1选择性
剪接异常在精神分裂症发病中的作用机制研究
中国科学院上海生命科学研究院 生命科学部 遗传学与生物信息学 王佳伟 植物小分子
RNA的生物学功能
中国科学院遗传与发育生物学研究所 生命科学部 遗传学与生物信息学 焦雨铃 遗传学
与生物信息学
复旦大学 生命科学部 遗传学与生物信息学 李辉 人类起源与进化
华中农业大学 生命科学部 园艺学与植物营养学 徐强 果树种质资源与基因组学
山东农业大学 生命科学部 园艺学与植物营养学 任仲海 蔬菜学
浙江大学 生命科学部 园艺学与植物营养学 杨建立 植物营养逆境分子生理学
中国农业科学院植物保护研究所 生命科学部 植物保护学 陆宴辉 农业昆虫与害虫防治
南京农业大学 生命科学部 植物保护学 陶小荣 植物病毒学
中国农业大学 生命科学部 植物学 毛同林 植物细胞骨架
中国科学... 阅读全帖 |
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C********4
发帖数: 308 | 38 能不能展开说说protein被DNA barcoded是什么意思？
我想的还是in vivo的，能定量、高通量、高灵敏度，比如纯化蛋白复合物或者IP，可
以直接测得到的蛋白跟control比较；能做基于蛋白质的screen；像GWAS做病人样本测
序一样做蛋白质分析
fluorophores |
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a********k
发帖数: 2273 | 39 CNS还是很少电镜复合物结构吧？毕竟难度和分辨率都低不少 |
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a********k
发帖数: 2273 | 40 看看这个复合物吧，20S，还是cryo和负染结合的。NSF的结构至今没解过，而且整个复
合物也是非常重要的。这年头CNS不太可能要negative stain 的EM结构的。不过我没看
elife那个结构，可能有过人之处吧。
Nat Struct Mol Biol. 2012 Feb 5;19(3):268-75. doi: 10.1038/nsmb.2237.
Structural characterization of full-length NSF and 20S particles. |
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a********k
发帖数: 2273 | 41 CNS还是很少电镜复合物结构吧？毕竟难度和分辨率都低不少 |
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a********k
发帖数: 2273 | 42 看看这个复合物吧，20S，还是cryo和负染结合的。NSF的结构至今没解过，而且整个复
合物也是非常重要的。这年头CNS不太可能要negative stain 的EM结构的。不过我没看
elife那个结构，可能有过人之处吧。
Nat Struct Mol Biol. 2012 Feb 5;19(3):268-75. doi: 10.1038/nsmb.2237.
Structural characterization of full-length NSF and 20S particles. |
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s******y
发帖数: 28562 | 43 哦！是用negative staining 的啊。那我倒是必须看看他们怎么做出来结论的。
因为在我理解中一般复合物必须用冷冻电镜才有说服力的吧? 除非是一个管状物
的横截面什么的。
credit |
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n********y
发帖数: 187 | 44 这"NTCP是受体复合物中最重要的组成部分"的结论可不能由这10% 说明---这我外行都
能看出来
如果有一个能50%的不是超级组成部分了??
--- 我外行觉得是应该把原细胞里面的NTCP给干掉,看看HBV还能不能感染,如果感染是0
.0%;而相对没有干掉NTCP的原细胞的10%,这和转了NTCP的老鼠肝细胞能被感染综合起来
才能比较清楚说明问题. 但是没有~100% 对0.0%, 我觉得这也只能说是比较清楚,不然
的话完整性就差强人意了.
另外这感染后的上清里面HBV的DNA少的问题你还没解释清楚呢?
我的外行理解是如果感染完整后的几个CYCLE下来就应该和转染没区别了.
如果有区别就说明这转了NTCP的细胞仍然不是一个完整的体外HBV模型,至少效率上差多
了. 孔博士不是说 "hAV能使兔肝细胞有特异性结合SHBsAg的能力，导致其对HBV易感。
含hAV培养的兔肝细胞感染HBV后，能检测到HBV mRNA、HBsAg、HBcAg、cccDNA和分泌的
HBV-DNA。而在不含hAV的培养兔肝细胞中，不能检测到HBV复制的标志。"
再拷贝了孔博士的有关上清里面HBV-DNA低的话... 阅读全帖 |
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y***y
发帖数: 709 | 45 您可以稍微解释一下您说的in vivo crosslink吗？
我们已经做了MS，并确认了几个位点确实有磷酸化
我坐在这里想象一下：
如果有这么一种slide，上面点着各种不同激酶的特异性抗体，当用激酶的混合物和
slide杂交之后，激酶就会结合在各自的抗体之上，洗掉激酶混合物以及非特异性结合
之后，放在目标蛋白和标记了的ATP溶液中，一段时间后加蛋白交联剂，把和激酶作用
的目标蛋白交联在激酶和抗体复合物上，洗脱，扫片子，有标记信号的点表示该抗体所
对应的激酶们就是目标蛋白磷酸化的激酶。
这个实验能够实现的话，那就是满足我需要的dream experiment。其中最难的应该是蛋
白交联这一步了。如果有公司想研发这种真正的kinase profiling的话，尽管拿这个
idea去研发，我不收专利费，哈哈 |
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e****s
发帖数: 1125 | 46 大家提到Kobilka不就是说解出了GPCR和beta2-Gs复合物的结构？一点也不掉价啊。 |
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h*****9
发帖数: 4028 | 47 第一个解出蛋白结构，第一个膜蛋白，第一个解出病毒复合物等结构的意义完全不一样。 |
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m*******8
发帖数: 256 | 48 最近用昆虫细胞分泌表达了两个蛋白的复合物，his tag纯化以后用Amicon浓缩体积到
300ul左右上Superdex 200柱子，结果只有很低的峰。跑了PAGE胶，gel filtration之
前取了1/150体积的样，蛋白量很多，过柱子后的fraction取了1/20的样，基本看不到
条带。把所有的fraction收集起来再用Amicon浓缩，也没蛋白，不知道蛋白哪里去了？
过柱子时奇怪的是基线一开始就从0 mAU跳到30 mAU，目的蛋白处的峰只有45mAU,在一
个柱体积快结束的时候突然出现很多500mAU左右的峰，不知道是什么东西。辛辛苦苦搞
了这么多蛋白全没了，很沮丧，关键是不知道哪里出错了，哪位大侠能指点迷津，不胜
感激！ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 49 哦，蛋白B，C的pI正常，都是5左右的
但是跟蛋白A的相互作用应该不是由表面电荷相反造成的non-specific interaction
用一些能买到的high pI蛋白做过control试验 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 50 you can try Dynabeads
i.e.
PMID 22991688
Denisin AK et al.
Post-collection processing of Schirmer strip-collected human tear fluid
impacts protein content. (2012).
Analyst. 137: 5088-96.
recombinant human lysozyme 14 kDa, pI=10.2–11
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22991688 |
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