Y*X
发帖数: 1 | 1 大家好,我有一个RDRP,在大约2-4mM Mg2+的浓度下有polymerase的活性.现在我们做了
很多突变,想确定镁离子的结合位点.请问下大家有没有什么好的方法能够检测蛋白与镁
离子相互作用或者结合常数的. 这个结合的KD估计在mM级或者几百uM级. |
l*********1
发帖数: 351 | |
b******y
发帖数: 627 | 3 How big is your protein? If it is small, NMR is the best for a KD at your
specified range. |
e****s
发帖数: 1125 | 4 我会先试各种光谱的，比如看看Mg的加入会不会让蛋白的荧光(Trp)或者可见-UV光谱产
生变化，有变化，那就恭喜了，做Titration就好了。
另外不知道离子Mg会不会有比较好的光谱,比如Raman之类的，如果蛋白的光谱没有明显
变化，可以从金属的光谱来做。
【在 Y*X 的大作中提到】
: 大家好,我有一个RDRP,在大约2-4mM Mg2+的浓度下有polymerase的活性.现在我们做了
: 很多突变,想确定镁离子的结合位点.请问下大家有没有什么好的方法能够检测蛋白与镁
: 离子相互作用或者结合常数的. 这个结合的KD估计在mM级或者几百uM级.
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B***Q
发帖数: 182 | |
m**z
发帖数: 787 | 6 re.
Mg-binding UV不会有变化，intrinsic fluorescence值得一试。或者用能bind Mg的
fluoresent probe做competition titration.又或者equilibrium dialysis.ITC,NMR也
可以，但是不容易做，蛋白需要量也大。
还有一个值得一试的是：用Co先代替Mg作titration.Co binding通常伴随UV变化，然后
加Mg来compete with Co.这样数据分析也能得到Co/Mg binding constant.
【在 e****s 的大作中提到】
: 我会先试各种光谱的，比如看看Mg的加入会不会让蛋白的荧光(Trp)或者可见-UV光谱产
: 生变化，有变化，那就恭喜了，做Titration就好了。
: 另外不知道离子Mg会不会有比较好的光谱,比如Raman之类的，如果蛋白的光谱没有明显
: 变化，可以从金属的光谱来做。
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w***7
发帖数: 45 | 7 Mark this one.
谱产
明显
【在 m**z 的大作中提到】
: re.
: Mg-binding UV不会有变化，intrinsic fluorescence值得一试。或者用能bind Mg的
: fluoresent probe做competition titration.又或者equilibrium dialysis.ITC,NMR也
: 可以，但是不容易做，蛋白需要量也大。
: 还有一个值得一试的是：用Co先代替Mg作titration.Co binding通常伴随UV变化，然后
: 加Mg来compete with Co.这样数据分析也能得到Co/Mg binding constant.
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e****s
发帖数: 1125 | 8 专家！
【在 m**z 的大作中提到】
: re.
: Mg-binding UV不会有变化，intrinsic fluorescence值得一试。或者用能bind Mg的
: fluoresent probe做competition titration.又或者equilibrium dialysis.ITC,NMR也
: 可以，但是不容易做，蛋白需要量也大。
: 还有一个值得一试的是：用Co先代替Mg作titration.Co binding通常伴随UV变化，然后
: 加Mg来compete with Co.这样数据分析也能得到Co/Mg binding constant.
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o****e
发帖数: 1011 | 9 这个比较靠谱
【在 B***Q 的大作中提到】
: ITC can do it.
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n**8
发帖数: 221 | |
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m**z
发帖数: 787 | 11 SPR不靠谱，没见过几个用SPR做metal-protein binding的例子.原因大概是把蛋白固定
住，bind个金属离子造成不了什么signal change吧
【在 n**8 的大作中提到】
: 透析，ITC， SPR
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p*****n
发帖数: 981 | 12 要得到准确的itc数据，几百um以上还是比较困难的。
不过往往不做不知道。如果你对蛋白浓度有信心，也不太在乎实际delta h,
那么kd应该还算准。
另外还要考虑到一个问题是mg的binding site有几个。
【在 o****e 的大作中提到】
: 这个比较靠谱
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l**********1
发帖数: 5204 | 13 LZ can try MST
Key Features
NanoTemper's unique MST technology has the following features and benefits:
Sample Preparation Features
measure affinities without surface immobilization, in free solution
measure label-free
measure affinities (KD, dissociation constant) between any (bio)molecules in
10 minutes
measure sub-nM to mM range of dissociation constants
equally applicable to a very large size range of molecules: measure ions,
fragments as well as nucleosomes and liposomes
study multi-component reactions like ternary complex formation, the order of
assembly, interfering factors, cooperativity and the like
discriminate between different binding sites on a target of interest
determine the number of binding sites of biomolecules
//www.nanotemper-technologies.com/technology/microscale-thermophoresis/
article/key-features/
or
//www.nanotemper-technologies.com/technology/
【在 p*****n 的大作中提到】
: 要得到准确的itc数据，几百um以上还是比较困难的。
: 不过往往不做不知道。如果你对蛋白浓度有信心，也不太在乎实际delta h,
: 那么kd应该还算准。
: 另外还要考虑到一个问题是mg的binding site有几个。
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o****e
发帖数: 1011 | 14 Kd几百uM，不意味着protein浓度一定要几百uM以上；(至少Mg离子浓度很容易提上去)
ITC数据可以“帮忙”回答binding site的问题。
【在 p*****n 的大作中提到】
: 要得到准确的itc数据，几百um以上还是比较困难的。
: 不过往往不做不知道。如果你对蛋白浓度有信心，也不太在乎实际delta h,
: 那么kd应该还算准。
: 另外还要考虑到一个问题是mg的binding site有几个。
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V**3
发帖数: 12756 | 15 要确保Mg和蛋白的结合有能检测到的热效应
这个可真说不准
【在 o****e 的大作中提到】
: 这个比较靠谱
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o****e
发帖数: 1011 | 16 当然没有绝对的事情。
我说的就是在前面提到的几个方法里比较的话，ITC会是我认为最有可能拿到
可靠的定量的数据的。
【在 V**3 的大作中提到】
: 要确保Mg和蛋白的结合有能检测到的热效应
: 这个可真说不准
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m**z
发帖数: 787 | 17 spectroscopy methods should be easier than ITC, and won't require large
amount of protein
【在 o****e 的大作中提到】
: 当然没有绝对的事情。
: 我说的就是在前面提到的几个方法里比较的话，ITC会是我认为最有可能拿到
: 可靠的定量的数据的。
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o****e
发帖数: 1011 | 18 和Mg结合时有特定的、“long wavelength”的吸收时，研究起来才会容易些。
protein的“intrinsic fluorescence”(比如Trp)可影响的因素太多，我不会把
它作为首选的定量研究“Mg binding event”的手段。
【在 m**z 的大作中提到】
: spectroscopy methods should be easier than ITC, and won't require large
: amount of protein
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o****e
发帖数: 1011 | 19 可以参考一下：
Biochemistry 2001, 40, 1423-1429
Thermodynamics of Ion-Induced RNA Folding in the Hammerhead Ribozyme:
An Isothermal Titration Calorimetric Study
【在 Y*X 的大作中提到】
: 大家好,我有一个RDRP,在大约2-4mM Mg2+的浓度下有polymerase的活性.现在我们做了
: 很多突变,想确定镁离子的结合位点.请问下大家有没有什么好的方法能够检测蛋白与镁
: 离子相互作用或者结合常数的. 这个结合的KD估计在mM级或者几百uM级.
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m**z
发帖数: 787 | 20 fluoresent probe can be used for a competition experiment. Or use Co to
produce the long wavelength (d-d transition) and back titrate Mg.
【在 o****e 的大作中提到】
: 和Mg结合时有特定的、“long wavelength”的吸收时，研究起来才会容易些。
: protein的“intrinsic fluorescence”(比如Trp)可影响的因素太多，我不会把
: 它作为首选的定量研究“Mg binding event”的手段。
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o****e
发帖数: 1011 | 21 这些都需要额外的hypotheses，相比较而言，我认为ITC才是更直接的手段。
【在 m**z 的大作中提到】
: fluoresent probe can be used for a competition experiment. Or use Co to
: produce the long wavelength (d-d transition) and back titrate Mg.
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m**z
发帖数: 787 | 22 intrinsic fluorescence受到很多因素影响，ITC又何尝不是呢。enthalpy change可以
由很多因素引起，buffer protonation/deprotonation,metal-buffer interaction,
precipitation,etc.所说得最直接其实measure也是这些的总和。反正ITC一直都不我
measure metal-protein interaction的首选，感觉有时候是个吃力不讨好的方法。。
。当然要是需要enthalpy/entropy,那就只有ITC了
【在 o****e 的大作中提到】
: 这些都需要额外的hypotheses，相比较而言，我认为ITC才是更直接的手段。
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o****e
发帖数: 1011 | 23 我说的是相比较而言。
即便是你说的spectroscopy method一样要考虑buffer的影响，一样要考虑比如
“precipitation”的问题，甚至还有金属离子和buffer结合造成吸收光谱变化
的问题。
而ITC至少不需要考虑你说的fluoresent probe本身对protein及其function的
影响（ITC不需要有tag的Mg或有tag的protein），不需要考虑Co与Mg不同的
binding site(s)以及造成“对protein function不同影响”的问题。
ITC研究Mg binding的例子我前面已经举过了。比普通spectroscopy method能
给出更多有用的信息。 |
m**z
发帖数: 787 | 24 我同意如果ITC顺利的话可以提供更多信息，但它不是我的首选。。buffer等的影响ITC
相对也严重些，因为蛋白浓度的关系。
Xiao Z & Wedd AG. Nat Prod Rep 2010, 27(5) 768-89.
这是一篇比较general的review,不是针对Mg的。。 |
l******n
发帖数: 143 | 25 象前面同学推荐的,光谱类的快速,简单,直接.作为首选很合适.
(1).Fluorescence Emission,最简单的看看tyrosine, tryptophan的化学环境有没有因
为Mg结合而变化,从而对荧光有影响.
(2).同时可以尝试Circular Dichroism,最简单的蛋白二级结构,如果不追究变化的源头
,而只是用变化作为信号去测量金属离子和蛋白作用的,很简单方便.
以上两个方法典型的应用有很多,比如calmodulin和钙离子作用.
注意:因为你需要测的是chemical equilibrium,如果反应很慢的话,需要保证滴定过程
每个滴定点(浓度)都要达到化学反应平衡.
SPR
这个不适合,首先是因为信号来自bulk solution(流动的溶液)中的分子被吸附到固定在
表面的蛋白上形成复合物,本质上因为质量吸附造成sensor surface附近媒介的折射率
改变.所以被吸附的质量大小直接影响了信号强弱.你的实验是Mg在bulk solution,这么
小的离子,几乎不可能产生什么明显的信号.这也是ligand-protein binding里很少用
SPR的原因.同时,SPR还有很多潜在问题,比如说蛋白被固定到表面,造成性质和构想改变
,一
部分亲和力丢失或者全部丢失等.同时multi-valent binding是最大的问题之一,也就是
说如果bulk solution里的analyte有多个结合位点,那么数据几乎是不可用作定量分析
的.因为avidity effect.
ITC
这个要保证有足够大的热量从反应中产生.对于Mg+protein, Ca+protein一般来说是满
足要求的.参见很多Dr. Michael Henzl (U of Missouri) 的文章. 有需要注意的地方
是,有的蛋白在ITC实验中对高速搅拌不适应,容易产生沉淀,所以要用相对低的速度和足
够长的时间间隔. 建议做了实验以后把溶液拿到UV-Vis spectrophotometer下读一下,
可以看看光散射有没有增加,或者放到Dynamic Light Scattering里前后实验(before
and after ITC)对比.
Hope this helps! |
l******n
发帖数: 143 | 26 还需要考虑蛋白上有几个结合位点, stoichiometry.
【在 Y*X 的大作中提到】
: 大家好,我有一个RDRP,在大约2-4mM Mg2+的浓度下有polymerase的活性.现在我们做了
: 很多突变,想确定镁离子的结合位点.请问下大家有没有什么好的方法能够检测蛋白与镁
: 离子相互作用或者结合常数的. 这个结合的KD估计在mM级或者几百uM级.
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