f*****n
发帖数: 499 | 1 小弟最近用SH-SY5Y做CRISPR。CRISPR本身是没问题的，但在single cell expansion的
步骤出了问题。
稀释法得到的单细胞在96孔板里生长大概一个星期，就长成一团细胞。但接着细胞就“
扩张”不下去了，只会在那一小团里越长越密，而不像其他细胞可以容易的长满整个96
孔板。
这时候我就用常规的Trypsin来消解，把这一团细胞打散。可问题是，这样处理后细胞
很快就死掉了。
我想请教：
1. SH-SY5Y从单细胞是否可以长满整个96-well的孔？这个细胞可以从single cell长成
一团，为何就无法继续扩张下去了呢
2. 我的问题主要出在哪里呢？我个人分析觉得最大可能是Trypsin过于harsh。而且我
在操作过程中可能Trypsin incubation的时间过长。那么有没有什么相对温和的
Trypsin可以替代呢？我网上查到比如Accutase，不知道大家还有什么别的推荐？
3. 除了SH-SY5Y, 还有什么其他human neuronal cell line推荐呢？感觉神经细胞总是
挺脆弱的。
非常感谢！ |
f*****n
发帖数: 499 | 2 ddd
96
【在 f*****n 的大作中提到】
: 小弟最近用SH-SY5Y做CRISPR。CRISPR本身是没问题的，但在single cell expansion的
: 步骤出了问题。
: 稀释法得到的单细胞在96孔板里生长大概一个星期，就长成一团细胞。但接着细胞就“
: 扩张”不下去了，只会在那一小团里越长越密，而不像其他细胞可以容易的长满整个96
: 孔板。
: 这时候我就用常规的Trypsin来消解，把这一团细胞打散。可问题是，这样处理后细胞
: 很快就死掉了。
: 我想请教：
: 1. SH-SY5Y从单细胞是否可以长满整个96-well的孔？这个细胞可以从single cell长成
: 一团，为何就无法继续扩张下去了呢
|
n**********g
发帖数: 196 | 3 建议在细胞长成一团时用yellow tip吹几次，会吹死一些细胞，但是会把一坨细胞吹成
很多小块甚至单细胞，很快就长满。 |
p****t
发帖数: 18 | |
f*****n
发帖数: 499 | 5 谢谢
比较好奇，
1.你说的“吹”就是直接在96孔板里用pipette“吹打”吗？
2.等于说直接“吹”就等于代替了trypsin的功能？细胞可以直接detached from
culture dish？
3. 不知道你的这个建议是针对sh-sy5y，还是所有细胞的crispr?
many thanks！
【在 n**********g 的大作中提到】
: 建议在细胞长成一团时用yellow tip吹几次，会吹死一些细胞，但是会把一坨细胞吹成
: 很多小块甚至单细胞，很快就长满。
|
r*h
发帖数: 24 | |
f*****n
发帖数: 499 | 7 electroporation
That works perfect
Lipo-3000 won't work at all
【在 r*h 的大作中提到】
: 楼主是用的什么转染方法？化学方法还是病毒？
|
v********a
发帖数: 646 | |
