f*******g
发帖数: 35 | 1 最近在养293T cells, 转染或者未转染的293T细胞放在FASC buffer (PBS+5% FBS）中
，然后在室温或者ice上放置两到三个小时，用7-AAD染色，发现60%的细胞都是 7-AAD+ （做 FACS的时候离 trypsinization差不多5-6小时吧）。刚刚trypsinized的细胞，然后立即作FACS， 7-AAD+的细胞比例很低，只有1-2%左右吧。
请问这种情况正常么？
我看到有的paper上， 293T细胞在室温或者冰上放置16个小时，然后用相应的抗体染色
，然后FACS 分析。 这种情况难道所有的293T 细胞不会全部死掉么？ 如果细胞都死了
，应该都会被染色吧 ？
高手来分析一下吧？谢谢！ | S*****s
发帖数: 287 | 2 你是不是检查一下你的 FACS Buffer？ 比如PBS 的 pH 值，是 1X 还是 10X PBS，FBS
有没有过期，或者 7-AAD 买了多久了？我也用 293T 做 Flow，样品分解成单细胞后
要花六到七个小时染色，然后每个样品里加 7-AAD 做对照。我的样品里 7-AAD
positive 的细胞都不多。我在 Negative 的细胞里 gate 一部分出来作为 P1，P1 一
般都在 70% 以上，另外有一部分 Negative 的细胞 FSC 和 SSC 值都很大我都不分析
了。你这个 50-60% 听起来有点吓人。或者你换一个染料来做这个实验，比如 DAPI？
如果 DAPI 的值和 7-AAD 的不一样说明两个药品当中有一个坏掉了。
AAD+ （做 FACS的时候离 trypsinization差不多5-6小时吧）。刚刚trypsinized的细
胞，然后立即作FACS， 7-AAD+的细胞比例很低，只有1-2%左右吧。
【在 f*******g 的大作中提到】
: 最近在养293T cells, 转染或者未转染的293T细胞放在FASC buffer (PBS+5% FBS）中
: ，然后在室温或者ice上放置两到三个小时，用7-AAD染色，发现60%的细胞都是 7-AAD+ （做 FACS的时候离 trypsinization差不多5-6小时吧）。刚刚trypsinized的细胞，然后立即作FACS， 7-AAD+的细胞比例很低，只有1-2%左右吧。
: 请问这种情况正常么？
: 我看到有的paper上， 293T细胞在室温或者冰上放置16个小时，然后用相应的抗体染色
: ，然后FACS 分析。 这种情况难道所有的293T 细胞不会全部死掉么？ 如果细胞都死了
: ，应该都会被染色吧 ？
: 高手来分析一下吧？谢谢！
| f*******g
发帖数: 35 | 3 谢谢你的回复 !
7-AAD应该是好的,我的293T细胞从培养皿detach后立即用7-AAD染色,viability挺高的,
有95%左右吧。但我用抗体染色时间长，要3-4小时，最后作FACS，7-AAD+ 的细胞就达
到了50-60%。
在室温下温育的时候， 死细胞和活的细胞明显分成两个population， 死细胞FSC明显变小了。
我的PBS是从公司买的， 1X，但从来没有测过pH。
谢谢 | f*******g
发帖数: 35 | 4 我的MSN f*******[email protected],你有时间能不能加我的MSN，详细聊聊呢？ 谢谢！
的,
显变小了。
【在 f*******g 的大作中提到】
: 谢谢你的回复 !
: 7-AAD应该是好的,我的293T细胞从培养皿detach后立即用7-AAD染色,viability挺高的,
: 有95%左右吧。但我用抗体染色时间长，要3-4小时，最后作FACS，7-AAD+ 的细胞就达
: 到了50-60%。
: 在室温下温育的时候， 死细胞和活的细胞明显分成两个population， 死细胞FSC明显变小了。
: 我的PBS是从公司买的， 1X，但从来没有测过pH。
: 谢谢
|
|
