e***o
发帖数: 344 | 1 正在做一个实验，需要把一个文库转到细胞里.但只能让一个细胞只含一分 DNA copy.
电转，Lipofectamine, virus等都是同时转多份copy。不知道，各位大虾有没有什么好
的建议，谢谢！ |
e***o
发帖数: 344 | 2 大家都没有什么好的建议吗？ 还是这个根本就是不现实？一个细胞只含有一种dna，多
份copy也行。效率低也没关系。
谢谢！ |
D*a
发帖数: 6830 | 3 定点Homologous recombination?
外行，瞎说的 |
T**********t
发帖数: 1604 | 4 我能想象的是增加细胞对文库的ratio，比方说你的文库里总共有100,000个copy，你就
用100，000，000个细胞来转这个文库。因为文库被充分稀释，那么每个细胞能够take
in的DNA不会超过两个。 |
n***w
发帖数: 2405 | |
e***o
发帖数: 344 | 6 感谢各位的回复与建议。
Homologous recombination的想法很好，我也想过用attp,phic31的办法来做，要先置
入attp site, 然后筛选，再接着转化。只是我用的是原代细胞，不能分化。所以在
筛选起来很麻烦。也不能象细菌那样screen.
降低dna总量应该可行，但是1pg dna 就有太多的copy 了，而且据说，减低dna 总量只
能降低转化效率，不能很好的降低单个细胞转化copy数。
也想过混一些junk DNA在文库里，可是也不能保证单copy，而且不知道重复性高不高。 |
m*****u
发帖数: 15526 | 7 降低DNA浓度就行。不就一个泊松分布么。倍比稀释。单细胞克隆怎么拿？
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【在 e***o 的大作中提到】
: 正在做一个实验，需要把一个文库转到细胞里.但只能让一个细胞只含一分 DNA copy.
: 电转，Lipofectamine, virus等都是同时转多份copy。不知道，各位大虾有没有什么好
: 的建议，谢谢！
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H****N
发帖数: 997 | 8 lentivirus usually transfects cells with single copies. |
j********r
发帖数: 156 | 9 People doing genome-wide screening often dilute virus to get a moi less than
1, then use the pool of virus to infect cell. In that case, theoretically
one cell is infected by one virus. If you need more details, try to read
papers from Elledge lab. Good luck, |
i*********t
发帖数: 78 | 10 For lentivirus, I use MOI 1:3 to get no more than one copy in a single cell
for my genomic shRNA library screening. |
Z******5
发帖数: 435 | 11 这个还真不一定吧，要考虑一下转染试剂的原理，会只包裹一个DNA分子？
【在 m*****u 的大作中提到】
: 降低DNA浓度就行。不就一个泊松分布么。倍比稀释。单细胞克隆怎么拿？
:
: .
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e***o
发帖数: 344 | 12 再次感谢各位的回复与建议。
受益匪浅！我手里的是AAV，不知道AAV降到一定的MOI后是否和lenti一样。 |
o*****a
发帖数: 2335 | 13 为啥不行？emulsion PCR不是也号称只包一个分子吗？
【在 Z******5 的大作中提到】
: 这个还真不一定吧，要考虑一下转染试剂的原理，会只包裹一个DNA分子？
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w********u
发帖数: 5457 | |
