c********u
发帖数: 250 | 1 今天做western，blot with anti-atubulin as loading control,为毛所有其它tissue都
好就是liver一点点信号都没有啊，俺用的是RIPA buffer to homogenize tissues，谢
谢先 |
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j********r
发帖数: 156 | 2 以前听说过，cleaved capase3/9的检测 using immunoblot 需要用sds sample buffer
to lyse the cells. 如果用other lysis buffer, such as RIPA, there are might
be problems. Not sure if this is true. |
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n**8
发帖数: 221 | 3 本人分子生物学菜鸟。。。
在做RNA-IP， 想用特异性的抗体把一个细胞核内的蛋白（RBP)binding的RNA pulldown
下来，
试过几种buffer，但是都不理想，
用过RIPA buffer 虽然可以IP到目标蛋白， 但是好像RBP-RNA complex 被打散了。RNA
没有被
IP下来。。。
2006年的两篇Nat protocol 文章用到Polysome lysis buffer去IP RNA。
(Peritz et al., 2006; Keene et al., 2006).我也试了一下，发现目标蛋白没能IP下
来，
连IP input WB 也detect不到这个RBP， 猜测lysis条件可能太gentle了，核膜没有破。
请教有RIP经验的大侠，有没有其他的好用的RIP buffer？
Any suggestions are appreciated!
不甚感激！ |
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S*****s
发帖数: 287 | 4 我用的和你一样的 beads，试过 RIPA 和 PBS，都 work。实在不放心建议你用点样品
试一下。 |
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m*****n
发帖数: 760 | 5 能从RIPA lysate里面提genomic DNA吗？
提出来的DNA只需要能做PCR模板就行。 |
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m*****n
发帖数: 760 | 6 RIPA buffer溶解细胞，超速离心之后的上清用来做WB，
我的问题就是能不能从离心后的pellet里面提DNA，
理论上genomic DNA应该是在这个pellet里的，对吧？
怎么才能把这个DNA个extract出来？ |
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X******n
发帖数: 24 | 7 是不是我的lysis buffer不对（我用的RIPA）,还是说要sonicate lysate? 帮指点一下
，谢谢阿! |
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m**********d
发帖数: 137 | 8 IHC及IF显示蛋白A在tumor cell的细胞核里高表达，蛋白A的canonical function是与
蛋白B bind并激活B。一些preliminary data提示蛋白A有新的功能，就是与蛋白C
bind而调控另一个重要的生物过程。
现在需要得到A与C直接作用的证据，下面这个用Dynal magnetic beads做CO-IP的
protocol：
10μl Dynal beads coated with protein A+10μl Dynal beads coated with
protein G each reaction, wash with ice cold PBS plus 5% BSA, three times.
Incubate with antibody against 蛋白A (20μl, approximately 4μg) in 500μl
PBS plus 5%BSA, overnight.
2^106 cells/10cm plate, treatment (which induces A and C interaction while
... 阅读全帖 |
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g***s
发帖数: 30 | 9 我们的方法是：裂解buffer：RIPA ，裂解方法：磁珠快速震荡，破碎larva。然后离心
，加入SDS loading buffer.
结果western结果很奇怪，经常出现一部分样品western没有任何信号，另外一部分完全
正常的情况。跟抗体肯定没关系，因为我们用一些非常好用的如tubulin actin都试过
了。
各位有遇到过类似的问题吗？ 能给支支招吗 |
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d****i
发帖数: 2346 | 10 你的buffer用的是RIPA buffer吗？我用的是这个，里面有EDTA，不知道是不是buffer
的原因。但是又看到说EDTA不超过1mM就可以。
还有一定要用PVDF膜吗？老板说可能也有关系。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 11 你的buffer用的是RIPA buffer吗？我用的是这个，里面有EDTA，不知道是不是buffer
的原因。但是又看到说EDTA不超过1mM就可以。
还有一定要用PVDF膜吗？老板说可能也有关系。 |
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D******9
发帖数: 2665 | 12 用了RIPA buffer，蛋白几乎都在cell pellet里。 谢谢 |
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c********r
发帖数: 189 | 13 打算做一个transcription factor的 co-IP，这个蛋白主要在核内表达，表达量不高，
RIPA buffer提的话，这个蛋白不溶解，还在pellet内。可以用高盐和denature来提，
但是就影响protein interaction了。
问问大伙，用什么方法裂解细胞或细胞核比较好？
很多paper中看到，cryolysis的方法比较好，但是实验室没有相关的设备。 |
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c********b
发帖数: 363 | 14 楼上的思路不错。
其实方法很多，但是比较简单的还是先crosslink，然后再用 harsh buffer把核裂开，
然后复性，最后该干嘛干嘛。
这里有一篇你可以参考：Rapid and phosphoinositol-dependent binding of the SWI
/SNF-like BAF complex to chromatin after T lymphocyte receptor signaling
我自己用的protocol是这样的：
如果只是检测蛋白表达:
用High SDS buffer:
15 mM Tris pH 8.8, 5% SDS
0.3 M DTT, 15% Glycerol
我的是植物细胞,一般是liquid nitrogen grind之后加buffer,boil.如果是cell line,
collect细胞之后加上buffer 然后直接煮.除非是非常不稳定的蛋白,不然连protease
inhibitor都可以不加.
看到蛋白之后如果是做IP:
先crosslonk(用什么chemical得自己琢磨),然后把ripa的SDS含量加到1% ,... 阅读全帖 |
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a******c
发帖数: 597 | 15 我一直觉得，用更strigent的washing的办法，其实远不如在binding上下功夫摸索更好
的IP条件。我遇到过的一个真实例子是，我已经用含有SDS的RIPA buffer作为细胞裂解
和washing beads的buffer了，control IP那里仍有signal。最后采用缩短Antibody
binding的时间的办法，最后解决了这个问题。 |
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n**8
发帖数: 221 | 16 请问大侠，想裂解cultured cell，然后western blot detect一个核内的蛋白.
用的是RIPA buffer：
150 mM NaCl
1% NP40
0.5% of Sodium Deoxycholate
0.1% sodium dodecylsulfate (SDS)
50 mM Tris
请问这个buffer能破核膜么？（这个蛋白本身的丰度不高）
需不需要超声？
不甚感激！ |
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c********b
发帖数: 363 | 17 你的loading dye dilute 之后就是2% SDS啊，loading 没关系的，5%的我都用过，
dilute到2%也能跑。
一般如果是DNA binding蛋白最好上2%SDS, 不然就RIPA+Benzonase (多麻烦啊）。 |
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w*********n
发帖数: 439 | 18 各位大侠,
请问版上有谁在按照Rich Young的CHIPprotol在作的？我发现拿Young的Wash Buffer
RIPA 洗不干净beads，有人有同样感觉吗？ |
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w*********n
发帖数: 439 | 19 多谢指教~
我看到别的protocol比如Upstate的protocol是用low salt, High salt, Licl, TE
这4个buffer 各洗2遍， 但是Rich Young 的protocol是用RIPA/Licl这一种buffer洗4-
7遍
我有点怀疑。 |
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w*********n
发帖数: 439 | 20 多谢指教~
我看到别的protocol比如Upstate的protocol是用low salt, High salt, Licl, TE
这4个buffer 各洗2遍， 但是Rich Young 的protocol是用RIPA/Licl这一种buffer洗4-
7遍
我有点怀疑。我再试一下Rich Young的protocl |
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k*****n
发帖数: 323 | 21 4－5次ripa已经是非常严谨的洗法了，有时候如果抗体不是很好用的话，我都会减少到
3次。私信问你做chip－seq还是microarray也不说，问你negative control也不说。我
都做了几百个chip－seq了。帮你trouble shooting还不搭理人。whatever |
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j****t
发帖数: 1663 | 22 你的观察应该是对的，光用RIPA/Licl洗背景会高一些吧，不如low salt, High salt,
Licl洗得干净，但洗得太干净了也会降低IP的效果。但是不管用什么buffer，都应该不
会太影响最后的结果（如果TF binding 很强的话）。
对于positive control region来说，用IgG来IP可能会得到一条很弱的band，用抗体IP
应该得到很强的band.不知道你选的negative region是否前面报道过，你也可以自己选
一些negative region来做PCR.如果你发现用抗体做ChIP，positive region和negative
region都能扩出带来，试试减少一下PCR cycle。但最好还是用real-time qPCR吧，因
为如果你的positive 和negative之间的差异非常小（小于one PCR cycle），就很难用
regular PCR的方法看出来。
最后一个可能性就是，你确定你用的试验条件能activate你的转录因子吗？最好做ChIP
之前confirm一下（用biochemistry的方法）。
总之，... 阅读全帖 |
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b**********8
发帖数: 349 | 23 新鲜的肿瘤组织，很宝贵，用RIPA lysis buffer提取总蛋白，请大家推荐个可靠地保
存方法，
1）直接冻于-80？or
2）添加 SDS loading dye之后冻于-80？or
3）添加 SDS loading dye并denature之后冻于-80？
先行谢过 |
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j****3
发帖数: 48 | 24 实验室有floxed的老鼠，打算注射Adnovirus给Cre recombinase...从一家公司买了一
个Ad-Cre,是有CMV promoter的，已经感染了HEK293细胞，收了细胞后（还没提纯），
现在想先看看病毒带的Cre序列有没有表达。跑了PCR可以看到带，但是WESTERN BLOT(
把HEK细胞裂解在RIPA buffer)用抗体却找不到Cre蛋白.咋回事呢？从没和病毒打过交
道，如果问的太傻，请尽量拍砖。。多谢 |
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q******g
发帖数: 3858 | 25 我想从FORMALIN FIXED的样品里提蛋白，用什么LYSIS BUFFER比较好啊？我现在用RIPA
BUFFER,但提不出蛋白啊。 |
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t**********8
发帖数: 223 | 26 谢谢你的热心回复。你冒似用的是两步裂解。你最后用的是RIPA buffer,不是SDS。我
的蛋白不用SDS可能抽不出来，我决定还是用1％SDS吧
cold
glycerol,
Add
mM
cold
0 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 27 CA630 1%
Immunoprecipitation of IMC components. Highly synchronized late-stage
parasites were purified over 70% (wt/vol) Percoll, and proteins were
extracted by
incubating them on ice for 15 min in RIPA buffer (1%
octylphenoxypolyethoxyethanol
[IGEPAL CA-630], 150 mM NaCl, 0.5% sodium deoxycholate
[DOC], 0.1% sodium dodecyl sulfate [SDS], 50 mM Tris, pH 7.4). Soluble and
insoluble fractions were separated by centrifugation at 12,000 g for 10
min at
4°C. Soluble lysates were incubated for 1 h... 阅读全帖 |
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d****i
发帖数: 2346 | 28 1. loading buffer经常是在临用之前加入DTT，那么如果加了DTT的loading buffer这
次没用完，再冻存起来，下次用的时候还加DTT吗？
2. 类似的问题，RIPA buffer中临用前加入sigma的inhibitor cocktail，那么这次没
用完再冻存起来，下次用的时候还加cocktail吗？
也许问题很简单，大家别笑话哈。谢谢！ |
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R****n
发帖数: 708 | 29 My tissue sample was homogenizd by micropestle in RIPA buffer+protease
inhibitors. The serial dilution results confirmed what you said 100ug/well,
cause my 1mg/well input showed strong signal from ERK and pERK both. I
boild my sample for 5 mins to denature proteins, not sure about your protein
. I am having some trouble in Standard curve now,but I will find out
tomorrow. |
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a*******a
发帖数: 4233 | 30 不用，直接细胞裂解煮10分钟去上样
我的条件是.45nc膜300毫安45分钟
做了6年组蛋白修饰的爬过
要是用ripa extract估计是拿不到 |
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w*******d
发帖数: 396 | 31 我试过下面的方法。材料是小鼠肝脏。供参考。
加PBS，匀浆（homogenize)，离心，裂掉RBC，加PBS，离心，用PBS洗一次，这时的上
清不再是浑浊的了，用RIPA buffer裂解细胞，离心，收集上清，BCA测蛋白浓度，
normalize. |
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d****i
发帖数: 2346 | 32 目前在做小肠组织的western，给RIPA buffer把SDS加到2%，然后sigma的protease
inhibitor cocktail加标准量的4倍(标准量是1：100稀释用的)，但是每次lysate里面
都有蛋白降解。。。。。。。。所以想除了inhibitor cocktail还能加点啥瞬间灭火
protease还能用于western？ |
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H****n
发帖数: 26 | 33 最近做一个Transcription Factor（120KD）的ChIP， 很奇怪的事情，--
前面标准的1% formaldyhe RT 10min，0.125M Glycine RT 5 min, PBS wash,
裂解完细胞后，温和的sonication完后，input用western看发现原来条带的位置没有（
或者变的很淡），在下面有两条小的蛋白带。 做了一下RNA pol-II的WB (>150kD <
200kD)也是类似的情况，原来条带的位置淡了很多，在底下出现了两三条size小的条带。
先后试了RIPA (0.1%SDS)和nuclear lysate(1%SDS)裂解，效果一样。只要有
sonication,即使是很温和的5个cycle 30s/30s (该条件下DNA shear都不完全200-
3000bp), 原来蛋白条带就会消失，取而代之的是底下出现的size小的条带。
请问这是sonication 导致大分子量的蛋白容易降解吗？要如何解决？ |
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x****s
发帖数: 29 | 34 用RIPA buffer把细胞重悬后rotate 20-30分，然后离心。sonication似乎增加核蛋白
裂解量时用。 |
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r******k
发帖数: 446 | 35 我就用1 percent的 sds的RIPA。 但是最主要的是你的GEL是不是15%的？因为histone
很小 如果不是 你肯定跑不出来 histone是非常strong的band 我5ug都能做出来。。 |
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f******k
发帖数: 856 | 36 我这个问题很奇特，我用Invitrogen的dynabeads做ChIP-seq，最后拉下来的DNA量总是
比较高，做qPCR也没有enrichment，但是用同样的protocol，换回agarose beads，就
很少碰到这种问题。这不合理啊，dynabeads按理说背景要比agarose beads低很多才对
啊？！不知道大家有没有碰到这种情况？我试过好几种洗的方法和试剂，比如最常用的
就是低盐洗一次，高盐洗一次,LiCl洗一次，TE洗两次。也试过用RIPA洗过，也试过大
量延长洗的时间，但是最后elute下来DNA的量还是比较高。
另外，能不能请推荐一个比较好的做转录因子ChIP-seq的盒子或者详细的homemade
protocol？我做的这个转录因子，比较low abundant，可是我的材料是primary tissue
，又没法一次拿到很多的细胞（一次运气好的话可以有50-100million）。看有的文章
说现在10million就可以做转录因子的ChIP-seq了，可是我从来没成功过。现在真是快
被逼死啦。。。。快救救我 ：（ |
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k*****n
发帖数: 323 | 37 try washing your Dynabeads with PBS 0.5% BSA 3 times, then incubate
antibodies in PBS-BSA for two hour. After IP, make sure resuspend beads
totally during each washing step. I never using sperm DNA. I would suggest
you using Pol II monoantibody 4H8 as positive control. Several steps are
critical for ChIP, 1, crosslinking, always using fresh FA, like 16% FA from
Thermo. for cells 15 min crosslinking with rotation would be enough, quench
with 0.125 M glycine for 1 min. 2 sonication, try Branson so... 阅读全帖 |
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f******k
发帖数: 856 | 38 Thanks very much for your input.
I actually tried washing the beads using RIPA multiple times and it did
reduce the DNA yield compared to using regular washing steps. However, the
overall DNA yield was still quite high. I've no idea why.
from
quench
.
you |
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f*********9
发帖数: 258 | 39 最简单的方法Tris pH7.4 加NaCL 浓度都是25 mM 外加0.5% 的NP40， 提细胞核棒棒的
，细胞核裂解可以用RIPA 直接sonicate |
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发帖数: 1 | 40 我买了他家的这个buffer了。我给客服写信了，他说他家的buffer有专利的，配方不公
开，他只能说是非离子型去垢剂，但是不是NP40，也不含Triton。
[在 florida2009 (福达) 的大作中提到：]
:最简单的方法Tris pH7.4 加NaCL 浓度都是25 mM 外加0.5% 的NP40， 提细胞核棒棒
的，细胞核裂解可以用RIPA 直接sonicate |
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c********b
发帖数: 363 | 41 MNase的话加点Ca应该可以，在植物细胞里面试过的。DNase I的话RIPA的盐浓度高了点。 |
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v********a
发帖数: 646 | 42 把不同的蛋白样品定量后，load相同量的蛋白样品做Western Blotting，但是出来结果
，总是出现loading control 的量并不一致，有的多，有的少。非常苦恼。
请问：如何能作出loading control 一致的Western Blotting？
知道这个问题很low，但乡下人就是这么菜。恳请达人指教诀窍：怎样处理组织或者细
胞样品，从而使SDS-PAGE上样量一致？谢谢。
我的方法：
细胞或组织用RIPA裂解
超声3次，15s on/15s off
离心12000rpm，取上清
将上清做2x梯度稀释，然后用bca kit测定浓度
取相同量的蛋白跑page
转膜，wb |
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发帖数: 1 | 43 第一个建议真的很有用 我一定试试
A和B确实都是一次跨膜蛋白
我也非常怀疑是否是false positive
确实用的NP40 buffer 提全蛋白（7号针头抽吸）
但现在结果是A和B的全长和cleavage都作用
而且cleavage要比全长作用强很多 且cleavage在胞内部分
所以我想这样B cleavage是否就不算膜蛋白 也就不行成micelle
为了避免这种可能 所以做截段看作用位点 这样也能抛开膜蛋白特性
不管如何还是希望尽快确定是false还是true
RIPA |
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R****n
发帖数: 708 | 44 最近有个项目要检测H3 modification和DNA modification的关系，做一些前期的试验
。准备pulldown histone, reversecrolink, 收集DNA做Dot blot.
直到SONICATION这一步都行,Chromatin reverse crosslink后 DNA在agar gel H3 在
page gel上都有信号。 但是pulldown后没有信号。主要基于 Farnham protocol。
他的ChIP buffer就是RIPA,beads也没有block,这个没问题么？有些别的protocol用
salmon DNA block beads,salmon DNA的methylation会影响 DNA methylation dot
blot结果吧？ |
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G******f
发帖数: 16223 | 45 nbc的一个新reality show，the marriage ref. seinfeld, kelly ripa, alec
baldwin是judges |
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r******m
发帖数: 5550 | 46 赫赫.赞~~~~~~~~ 看还是不看呢...听听评价再看好了
kelly ripa这姐姐我挺喜欢的 |
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