C*******e
发帖数: 4348 | 1 我们实验室用Thermo Scitific的Glutathione Agarose纯化GST-tag蛋白
他们的手册上说用Tris buffer
想问问看有没有人用过别的buffer
比如HEPES，phosphate，Bicine之类的？
打电话去tech support已经下班了：（ |
s******y
发帖数: 28562 | 2 这个我好像一般都是用HEPES buffer
【在 C*******e 的大作中提到】
: 我们实验室用Thermo Scitific的Glutathione Agarose纯化GST-tag蛋白
: 他们的手册上说用Tris buffer
: 想问问看有没有人用过别的buffer
: 比如HEPES，phosphate，Bicine之类的？
: 打电话去tech support已经下班了：（
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C*******e
发帖数: 4348 | 3 前辈分享个方子？
lysate/binding buffer
和elute buffer
你都用同一个么？
我看说明说binding最好pH 7.4，elute pH 8.0
可是我试过
效果并不比两个都是pH 8.0好多少
【在 s******y 的大作中提到】
: 这个我好像一般都是用HEPES buffer
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S*****s
发帖数: 287 | 4 我用的和你一样的 beads，试过 RIPA 和 PBS，都 work。实在不放心建议你用点样品
试一下。 |
C*******e
发帖数: 4348 | 5 谢谢！
不过这里我还是不太想用PBS buffer
因为要跟在cation exchange chromatography后面做
所以最理想的是用HEPES之类
【在 S*****s 的大作中提到】
: 我用的和你一样的 beads，试过 RIPA 和 PBS，都 work。实在不放心建议你用点样品
: 试一下。
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s******s
发帖数: 13035 | 6 应该可以吧。GST还是比较容易纯化的，不想histag
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢！
: 不过这里我还是不太想用PBS buffer
: 因为要跟在cation exchange chromatography后面做
: 所以最理想的是用HEPES之类
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s******y
发帖数: 28562 | 7 我很久以前做的了，一下子还找不出来了。不过，肯定是用同一个buffer,
我好像就是直接用pH 7.5.
GST purification 的关键点是Glutathione 最好要新鲜配，其他的基本无所谓
【在 C*******e 的大作中提到】
: 前辈分享个方子？
: lysate/binding buffer
: 和elute buffer
: 你都用同一个么？
: 我看说明说binding最好pH 7.4，elute pH 8.0
: 可是我试过
: 效果并不比两个都是pH 8.0好多少
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C*******e
发帖数: 4348 | 8 HEPES 25 mM
250-300 mM NaCl
pH 7.4
你看靠谱不？
我们不用glutathione洗脱
而是用GST tag的precision protease切
所以问题不大
【在 s******y 的大作中提到】
: 我很久以前做的了，一下子还找不出来了。不过，肯定是用同一个buffer,
: 我好像就是直接用pH 7.5.
: GST purification 的关键点是Glutathione 最好要新鲜配，其他的基本无所谓
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s******y
发帖数: 28562 | 9 盐有点高了。这个GST tag 纯化还是很特异的，不需要那么多盐吧？
【在 C*******e 的大作中提到】
: HEPES 25 mM
: 250-300 mM NaCl
: pH 7.4
: 你看靠谱不？
: 我们不用glutathione洗脱
: 而是用GST tag的precision protease切
: 所以问题不大
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I*****y
发帖数: 6402 | 10 I, too think the salt is too high. The critical thing is adjust the pH to 8
for the reduced form of glutathione, because it's very acidic - if I
remember right.
【在 s******y 的大作中提到】
: 盐有点高了。这个GST tag 纯化还是很特异的，不需要那么多盐吧？
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i*****g
发帖数: 11893 | 11 用Tris buffer 也可以 无关紧要，最多吸附量低一些.除非下一步做crosslink，Tris buffer 有干扰
beads 有sigma和GE healthcare两种，要买GE healthcare的那种，大概1990s 有人比
较过两种，GE吸附量可以大一倍 |
C*******e
发帖数: 4348 | 12 呃。。。。怎么说呢
我已经说了以前一直用Tris Buffer
这次不能用
因为要用阳离子交换柱，Tris有干扰
跟你说的crosslink有干扰相似又不尽然
（只有做primary amine基团的crosslinking才不能用Tris，crosslink不限于光做
primary
amine基团）
另外Glutathione Agarose不止sigma和GE两家
就像我原帖说的
我用的Thermo的(原Pierce)
Tris
buffer 有干扰
【在 i*****g 的大作中提到】
: 用Tris buffer 也可以 无关紧要，最多吸附量低一些.除非下一步做crosslink，Tris buffer 有干扰
: beads 有sigma和GE healthcare两种，要买GE healthcare的那种，大概1990s 有人比
: 较过两种，GE吸附量可以大一倍
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