a*******a
发帖数: 1240 | 1 我也想问同样的问题。
一个质粒，如何同时表达两个ORF？ |
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S*********s
发帖数: 304 | 2 Rudolf Jaenisch lab用T2A, P2A把四个ONSM是个factor放到了一个载体上同时表达四
个ORF.
Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic
vector
Bryce W. Careya,b,
Styliani Markoulakia,
Jacob Hannaa,
Kris Sahaa,
Qing Gaoa,
Maisam Mitalipovaa,1, and
Rudolf Jaenischa,b,1
http://www.pnas.org/content/106/1/157.abstract |
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B*******o
发帖数: 19 | 3 以惨痛的经验告诉你用IRES不能保证两个ORF的同时表达，个人也觉得2A更靠谱，同时
转录再剪切的。 |
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j******n
发帖数: 941 | 4
我的经验是切割率大约80% 整体表达效率比IRES高 而且在某些情况下 IRES前后两个
ORF表达情况不成比例 |
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l******a
发帖数: 3339 | 5 分泌型蛋白有办法搞2个ORF吗？ 如果用一个promoter的话。 |
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g***m
发帖数: 465 | 6 看看现有的database能够弄清哪些程度上的东西.
首先,不考虑codon preference条件下用NCBI的ORF
finder找到8个ORFs(P1-->P6),blastP结果如下:
检索ID:1050437955-05057-3024
P1 +1 ORF:250..13398 4383aa
bovine coronavirus RNA-directed RNA replicase
P2 +3 ORF:13584..21470 2629aa
同上,可能形成polyprotein complex
P3 +3 ORF:21477..25244 1256aa
surface projection glycoprotein of coronavirus
envelope protein
P4 +1 ORF:28105..29373 423aa
murine hepatitis virus nucleocapsid protein
P5 +2 ORF:25253..26077 275aa
Opsin, or malaria parasite Ca ATPase-like |
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C*I
发帖数: 4736 | 7 相比较而言，石正丽的《Bat origin of human coronaviruses/蝙蝠是人类冠状病毒的
来源》是扎扎实实的抓蝙蝠，解剖蝙蝠，分离病毒，对比DNA,RNA后得出得结论。
请lobbock读一读，说一说，走两步！
http://virologyj.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12985-015-0422-1
Review
Open Access
Published: 22 December 2015
Bat origin of human coronaviruses
Ben Hu, Xingyi Ge, Lin-Fa Wang & Zhengli Shi
Virology Journal volume 12, Article number: 221 (2015) Cite this article
Abstract
Bats have been recognized as the natural reservoirs of a large variety of
viruses. Special attention has ... 阅读全帖 |
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c***t
发帖数: 383 | 8 ☆─────────────────────────────────────☆
happylife (美丽人生) 于 (Sat Apr 6 00:59:10 2013, 美东) 提到:
谢谢气龙。以前不太知道orfe.
康家的事情出来，提醒了我给自己和老公买额外的保险，单位里面一两年的工资真的不
够。重病丢工作的话一起也丢了。宝宝版的跟帖里，我得到很好的货比三家的人寿保险
的资讯，每年两个人省了两百多美元，以后一直捐orfe.
康家我捐了，一点点心意。如果我在附近，如果我认识她，我想帮她在急需的时候带一
下小宝宝，
我家孩子三岁了，就一个，每次我出差，老公出差，留在家里那个遇到各种事情的话，
连个替手的人都没有，不敢想象长年累月单亲的压力和辛苦。
他们的孩子父亲没了，担子都在一个人身上了，兔死狐悲，即使她经济状况不至于太艰
难，我也想略表心意，一个周末不出去吃的几十块钱而已，不为别的，希望她哪天病了
或有急事的时候可以用来请几个小时的babysitter, 比隔空的安慰实用一点点，就这么
简单。
想捐的人不会因为捐了这个就觉得与捐那个矛盾。不想捐的人很大一部分横竖还是不捐
... 阅读全帖 |
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j****x
发帖数: 1704 | 9 说实话，这里能有什么可说教的？三楼认为不去除融合蛋白后面那个ORF里的ATG算是一
个初级错误，我不认同而已。融合蛋白表达载体，无论商用还是文献中报道的，保留后
面ORF里ATG的一大把。它们的设计者是不是都是犯了初级错误的初学者呢？实践中如果
确认出现了alternative translation,需要“检讨”的，首先应该是载体/序列设计：
前面fusion peptide的起始ATG是否存在最佳的Kozak consensus；转录起始位点到翻译
起始位点之间是否有足够的空间是否有特殊的序列/结构；序列中是否有IRES，位置是
不是有问题。而不是单纯把原因归结到没有去处后面ORF里的ATG。做改造的时候也未必
就非得突变下游ATG，因为如果前面的根源不解决，就算去除了后面ORF的起始ATG，整
个序列中也大概率会有其他ATG可能作为alternative translation的起始，所谓治标不
治本。至于终止翻译时连续使用两个甚至三个stop codon，我在需要的时候也这么做过
，但不会简单的把这种做法当成“金科玉律”，会分情况选择使用，当做tip推荐给别
人的时候也会解释原... 阅读全帖 |
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h*****8
发帖数: 4754 | 10 U.S. OPTIONS EXCHANGE REGULATORY FEE (ORF)
Starting February 1, 2010, a new pass-through exchange fee, referred to as
the Options Regulatory Fee (ORF), will be collected by IB on behalf of the U
.S. opti on exchanges. The fee will be assessed t o customer orders at a
rate of $0.014 per U.S. exchange listed option contract and is in addition
the IB commission char ge as well as any existing exchange fees . Its stated
purpose is to assist in offsetting exchange costs relating to the
supervision an... 阅读全帖 |
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S*******l
发帖数: 4637 | 11 The genome of SARS-CoV consists of a single, positive-strand RNA that is
approximately 29,700 nucleotides long. The overall genome organization of
SARS-CoV is similar to that of other coronaviruses. The reference genome
includes 13 genes, which encode at least 14 proteins. Two large overlapping
reading frames (ORFs) encompass 71% of the genome. The remainder has 12
potential ORFs, including genes for structural proteins S (spike), E (small
envelope), M (membrane), and N (nucleocapsid). Other pot... 阅读全帖 |
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C*I
发帖数: 4736 | 12 一直在误导，现在还在误导。 说说明corona virus 不可以从蝙蝠直接传染给人，必须
经过一个中间宿体性的其它动物才能传染给人。所以，病毒发生后，就故意误导全国人
民去海鲜市场找证据，找其它野生动物的麻烦。 而且还是病毒所去找的，找完了还装
模做样化验呀，分离呀什么的。最后把责任全部推给了海鲜市场的动物。可是那种动物
，一直不敢说，说了其它相关已经在人就会去早那种动物监测。 所以压根不说，打马
虎眼。
事实上，早在2013 年，就是这个武汉病毒研究所，已经从来自云南的蝙蝠身上所携带
的corona virus中分离出第一株蝙蝠SARS类似样的冠状病毒的活病毒，其中就包含了类
似于S类型的基因。从而证实这株病毒能够使其接受和SARS病毒相同的受体，并能够感
染人的细胞。对此新发现，武汉病毒所还把它以武汉病毒研究所的英文简称命名“WIV1
”，以彰显这一发现的重要价值和属于自己第一个发现的巨大研究成果。这个成果刊载
于2013年11月的《自然》杂志。
就是说，从云南弄回来的这种蝙蝠所携带的类似于sars的 corona virus， 可以不经过
其它受体/宿体，而直接传染给人。 他们... 阅读全帖 |
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C*I
发帖数: 4736 | 13 一直在误导，现在还在误导。 说说明corona virus 不可以从蝙蝠直接传染给人，必须
经过一个中间宿体性的其它动物才能传染给人。所以，病毒发生后，就故意误导全国人
民去海鲜市场找证据，找其它野生动物的麻烦。 而且还是病毒所去找的，找完了还装
模做样化验呀，分离呀什么的。最后把责任全部推给了海鲜市场的动物。可是那种动物
，一直不敢说，说了其它相关已经在人就会去早那种动物监测。 所以压根不说，打马
虎眼。
事实上，早在2013 年，就是这个武汉病毒研究所，已经从来自云南的蝙蝠身上所携带
的corona virus中分离出第一株蝙蝠SARS类似样的冠状病毒的活病毒，其中就包含了类
似于S类型的基因。从而证实这株病毒能够使其接受和SARS病毒相同的受体，并能够感
染人的细胞。对此新发现，武汉病毒所还把它以武汉病毒研究所的英文简称命名“WIV1
”，以彰显这一发现的重要价值和属于自己第一个发现的巨大研究成果。这个成果刊载
于2013年11月的《自然》杂志。
就是说，从云南弄回来的这种蝙蝠所携带的类似于sars的 corona virus， 可以不经过
其它受体/宿体，而直接传染给人。 他们... 阅读全帖 |
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C*I
发帖数: 4736 | 14 Published: 30 October 2013
Isolation and characterization of a bat SARS-like coronavirus that uses the
ACE2 receptor
Xing-Yi Ge, Jia-Lu Li, Xing-Lou Yang, Aleksei A. Chmura, Guangjian Zhu,
Jonathan H. Epstein, Jonna K. Mazet, Ben Hu, Wei Zhang, Cheng Peng, Yu-Ji
Zhang, Chu-Ming Luo, Bing Tan, Ning Wang, Yan Zhu, Gary Crameri, Shu-Yi
Zhang, Lin-Fa Wang, Peter Daszak & Zheng-Li Shi
Nature volume 503, pages535–538(2013)Cite this article
Abstract
The 2002–3 pandemic caused by severe acute respirator... 阅读全帖 |
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f*****g
发帖数: 15860 | 15 ☆─────────────────────────────────────☆
valence (汽车工人) 于 (Sat Mar 31 02:33:47 2007) 提到:
买了张UA MAY ２nd的机票，是ORF－ORD－PVG，
M class, 用了３０K里程想升级，结果ORF－ORD是确认了，ORD－PVG是waitlisted了，
这样ORD－PVG是不是没戏了？我是最底层的GM。:(
☆─────────────────────────────────────☆
littlestone (小石头@@@心有千千结) 于 (Sat Mar 31 03:01:08 2007) 提到:
碰运气。
要是升不了3万还不还？
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valence (汽车工人) 于 (Sat Mar 31 03:07:00 2007) 提到:
好象只还１５K，因为ORF－ORD要１５K，这样就亏大了。
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zzzzh |
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c*********e
发帖数: 16335 | 16 用性换生活保障 奥地利"干妈"包养年轻难民成风
文章来源: 国际在线 于 2017-08-02 15:23:21
“奥地利年长女性拿钱包养难民!”
瑞士《20分钟报》2日报道称，自2015年以来，奥地利涌入十多万难民。现在，越来越
多的年轻难民有了所谓的“干妈”，他们用性来换“干妈们”的钱物。
奥地利广播集团(ORF)1日称，该国的一些酒吧是难民和本国一些年长女性的公开约会场
所。24岁的哈桑就是在酒吧里认识自己的“干妈”的。这位名叫琳达的“干妈”五十多
岁，她邀请哈桑到一家酒吧喝酒。几杯酒后，琳达邀请哈桑去她家，他们之后发生了性
行为，并从那时起开始定期约会。后来，琳达让哈桑搬到自己家，并付钱让哈桑到健身
中心健身，给他买衣服，手机话费和食物也由琳达“承包”，哈桑也不需要支付房租。
“她一天想要跟我做爱四次。我对她来说，就是一个性爱机器，除此外没什么用处。”
哈桑对维也纳杂志《碧贝尔》说道。
哈桑的故事并不是个案。ORF采访了难民中心的部分难民，很多人表示，他们身边也有
类似的事情。26岁的塔里克在难民中心与一名51岁的德语女老师建立了包养关系，这位
女老师甚至要求他抛弃远方的妻子和... 阅读全帖 |
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w*********r
发帖数: 42116 | 17 奥地利广播集团(ORF)1日称，该国的一些酒吧是难民和本国一些年长女性的公开约会场
所。24岁的哈桑就是在酒吧里认识自己的“干妈”的。这位名叫琳达的“干妈”五十多
岁，她邀请哈桑到一家酒吧喝酒。几杯酒后，琳达邀请哈桑去她家，他们之后发生了性
行为，并从那时起开始定期约会。后来，琳达让哈桑搬到自己家，并付钱让哈桑到健身
中心健身，给他买衣服，手机话费和食物也由琳达“承包”，哈桑也不需要支付房租。
“她一天想要跟我做爱四次。我对她来说，就是一个性爱机器，除此外没什么用处。”
哈桑对维也纳杂志《碧贝尔》说道。
哈桑的故事并不是个案。ORF采访了难民中心的部分难民，很多人表示，他们身边也有
类似的事情。26岁的塔里克在难民中心与一名51岁的德语女老师建立了包养关系，这位
女老师甚至要求他抛弃远方的妻子和女儿。
许多难民后来都表示，后悔有这种关系，但却离不开“干妈”。奥地利男性健康中心专
家布赫纳尔表示，“这些男人离开‘干妈’后，很可能无家可归，失去物质来源。”奥
地利联邦心理治疗中心主席斯蒂皮尔则表示，这些难民往往很孤独，没有依靠，在此背
景下，他们“自愿”与“干妈”建立这样一种关系。
难民包... 阅读全帖 |
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w********2
发帖数: 632 | 18 HGT involving prokaryotes
Many studies support the significant role of HGT in the evolution of
prokaryotes (Gogarten et al., 2002; Jain et al., 2003; Kunin and Ouzounis,
2003). The principle sources of novel genes are provided by other prokary-
otes, viruses and MGEs (Fig. 1). In particular, plasmids and composite
mobile elements contribute significantly to HGT between prokaryotes. In some
cases, composite elements and megaplasmids are composed of more than 100
genes (Bentley et al., 2002; Hacke... 阅读全帖 |
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s********t
发帖数: 4150 | 19 瑞士《20分钟报》2日报道称，自2015年以来，奥地利涌入十多万难民。现在，越
来越多的年轻难民有了所谓的“干妈”，他们用性来换“干妈们”的钱物。
奥地利广播集团(ORF)1日称，该国的一些酒吧是难民和本国一些年长女性的公开
约会场所。24岁的哈桑就是在酒吧里认识自己的“干妈”的。这位名叫琳达的“干妈”
五十多岁，她邀请哈桑到一家酒吧喝酒。几杯酒后，琳达邀请哈桑去她家，他们之后发
生了性行为，并从那时起开始定期约会。后来，琳达让哈桑搬到自己家，并付钱让哈桑
到健身中心健身，给他买衣服，手机话费和食物也由琳达“承包”，哈桑也不需要支付
房租。“她一天想要跟我做爱四次。我对她来说，就是一个性爱机器，除此外没什么用
处。”哈桑对维也纳杂志《碧贝尔》说道。
哈桑的故事并不是个案。ORF采访了难民中心的部分难民，很多人表示，他们身边
也有类似的事情。26岁的塔里克在难民中心与一名51岁的德语女老师建立了包养关系，
这位女老师甚至要求他抛弃远方的妻子和女儿。
许多难民后来都表示，后悔有这种关系，但却离不开“干妈”。奥地利男性健康
中心专家布赫纳尔表示，“这些男人离开‘干妈’后，很可能无家可归，失去... 阅读全帖 |
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n******g
发帖数: 17225 | 20 [环球时报驻德国特约记者 青木]“奥地利年长女性拿钱包养难民！”瑞士《20分
钟报》2日报道称，自2015年以来，奥地利涌入十多万难民。现在，越来越多的年轻难
民有了所谓的“干妈”，他们用性来换“干妈们”的钱物。
奥地利广播集团（ORF）1日称，该国的一些酒吧是难民和本国一些年长女性的公开
约会场所。24岁的哈桑就是在酒吧里认识自己的“干妈”的。这位名叫琳达的“干妈”
五十多岁，她邀请哈桑到一家酒吧喝酒。几杯酒后，琳达邀请哈桑去她家，他们之后发
生了性行为，并从那时起开始定期约会。后来，琳达让哈桑搬到自己家，并付钱让哈桑
到健身中心健身，给他买衣服，手机话费和食物也由琳达“承包”，哈桑也不需要支付
房租。“她一天想要跟我做爱四次。我对她来说，就是一个性爱机器，除此外没什么用
处。”哈桑对维也纳杂志《碧贝尔》说道。
哈桑的故事并不是个案。ORF采访了难民中心的部分难民，很多人表示，他们身边
也有类似的事情。26岁的塔里克在难民中心与一名51岁的德语女老师建立了包养关系，
这位女老师甚至要求他抛弃远方的妻子和女儿。
许多难民后来都表示，后悔有这种关系，但却离不开“干妈”。奥地利男性健康中
... 阅读全帖 |
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U********n
发帖数: 1010 | 21 Money Market Dividends Paid: 是股票给你的分红，你看看时间和股票的分红时间。
Regulatory Fees：是你买option后，每个contract， stock exchanger要收一定的费
用的。大约是 -$0.0030 per contract.
Options Regulatory Fee5
5The following options exchanges assess an Options Regulatory Fee (referred
to as the "ORF fee") on options transactions executed by its members that
clear in the customer range at Options Clearing Corporation ("OCC")
regardless of the marketplace of execution: Chicago Board Options Exchange (
"CBOE") - $0.0045 per contract; I... 阅读全帖 |
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E***r
发帖数: 1037 | 22 1. TastyWorks
Option Roundtrip Example (Including Commissions and Fees):
A roundtrip of 10 contracts for $5/contract would have
a total cost of $12.99 ($11.43 to open and $1.56 to close),
based on the following breakdown:
Cost to Open
Commission: $10.00 = ($1 x10)
Clearing Fee: $1.00 = ($0.1 x10)
ORF Fee: $0.43 = ($0.0431 x10)
Subtotal Cost: $11.43
Cost to Close
Commission: $0
Clearing Fee: $1.00 = ($0.1 x10)
FINRA TAF: $0.02 = ($0.002 x 10)
SEC Fee: $0.11 = ($0.0000218 ... 阅读全帖 |
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h*******e
发帖数: 1968 | 23 谢谢气龙。以前不太知道orfe.
康家的事情出来，提醒了我给自己和老公买额外的保险，单位里面一两年的工资真的不
够。重病丢工作的话一起也丢了。宝宝版的跟帖里，我得到很好的货比三家的人寿保险
的资讯，每年两个人省了两百多美元，以后一直捐orfe.
康家我捐了，一点点心意。如果我在附近，如果我认识她，我想帮她在急需的时候带一
下小宝宝，
我家孩子三岁了，就一个，每次我出差，老公出差，留在家里那个遇到各种事情的话，
连个替手的人都没有，不敢想象长年累月单亲的压力和辛苦。
他们的孩子父亲没了，担子都在一个人身上了，兔死狐悲，即使她经济状况不至于太艰
难，我也想略表心意，一个周末不出去吃的几十块钱而已，不为别的，希望她哪天病了
或有急事的时候可以用来请几个小时的babysitter, 比隔空的安慰实用一点点，就这么
简单。
想捐的人不会因为捐了这个就觉得与捐那个矛盾。不想捐的人很大一部分横竖还是不捐
的。
捐款要规范，方式值得改进，也有道理。但对我来说，就是那么一点点小心意而已。没
指望是什么救世主，也知道mit这事了不起捐个几千块。我自己本人是很节省的。婚戒
一个素圈圈三十美元，最小最细的那种... 阅读全帖 |
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b*****d
发帖数: 61690 | 24 [环球时报驻德国特约记者 青木]“奥地利年长女性拿钱包养难民！”瑞士《20分钟
报》2日报道称，自2015年以来，奥地利涌入十多万难民。现在，越来越多的年轻难民
有了所谓的“干妈”，他们用性来换“干妈们”的钱物。
奥地利广播集团（ORF）1日称，该国的一些酒吧是难民和本国一些年长女性的公开
约会场所。24岁的哈桑就是在酒吧里认识自己的“干妈”的。这位名叫琳达的“干妈”
五十多岁，她邀请哈桑到一家酒吧喝酒。几杯酒后，琳达邀请哈桑去她家，他们之后发
生了性行为，并从那时起开始定期约会。后来，琳达让哈桑搬到自己家，并付钱让哈桑
到健身中心健身，给他买衣服，手机话费和食物也由琳达“承包”，哈桑也不需要支付
房租。“她一天想要跟我做爱四次。我对她来说，就是一个性爱机器，除此外没什么用
处。”哈桑对维也纳杂志《碧贝尔》说道。
哈桑的故事并不是个案。ORF采访了难民中心的部分难民，很多人表示，他们身边
也有类似的事情。26岁的塔里克在难民中心与一名51岁的德语女老师建立了包养关系，
这位女老师甚至要求他抛弃远方的妻子和女儿。
许多难民后来都表示，后悔有这种关系，但却离不开“干妈”。奥地利男性健康中
... 阅读全帖 |
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z***h
发帖数: 998 | 25 【 以下文字转载自 OnTheRoad 讨论区 】
【 原文由 zzzzh 所发表 】
update single_single set ExpressionLevel = expression.ExpressionLevel w
here expression.ORF=single_single.matchORF;
想把expression table里的ExpressionLevel这一项按照ORF的关系
填到single_single.ExpressionLevel里去,未果....
错误信息是:
ERROR 1109: Unknown table 'expression' in where clause |
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r****r
发帖数: 379 | 26 这个要看具体情况，最后是去掉ORF的ATG
如果前面是个小tag，那么有的时候会从ORF自身的ATG开始翻译
如果前面是个gfp这样的tag，一般问题就不大了 |
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q*****d
发帖数: 445 | 27 我来回答你：以缺失基因的ORF为例
Chromosome: Promoter ORF Terminator
Plamsid: (Enzyme A) Promoter marker Termintator (Enzyme B)
你的质粒应该是这个上面的第二个结构，用A,B酶切之后，转化就OK了，你设计的结构
是很容易发现回复突变的，但是可以用Marker进行筛选。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 28 你先看看这个基因有没有的卖，用纯的plasmid作template容易一点。
在你可以考虑在atg之前寻找合适的primer，先得到PCR product
然后再PCR ORF。
roche有一个high gc的PCR kit，用过还行。
从起始密码子开始，序列是这样的：
ATGCCGGCCGGCCGCGCCGCGCGC
gene本身65％GC含量,1.3Kb
打算从ES cell的cDNA pool中clone到lenti over expression vector，ES cell的cDNA
pool是从mRNA反转录得到的。目前试过TAKARA的LA taq，GC buffer，with or
without DMSO(5%),做了gradient Tm， 从53－58度，结果任何一个条件都不能PCR出片
断。现在想是不是因为起始序列太特别了，有没有特别的办法把这个ORF扩增出来？ |
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w********e
发帖数: 275 | 29 for gene prediction, there are many tools. If you don't want to miss any
genes,use ORF finder.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/
I think there should be other versions that allow you to set M as the
starting amino acid of ORF.
To see the difference on genes between two genomes, you can run a orthologs
comparison between two genomes. There are a number of those sites too, just
google. |
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E****A
发帖数: 184 | 30 如果一条mRNA在第一个和第二个exon上分别有一个AUG，并且有完整的ORF，只是ORF1比
ORF2多出几十个氨基酸，剩余的氨基酸序列完全相同。请问，这条mRNA在细胞里被翻译
时会从哪个AUG上开始翻译？会同时被翻译成两条多肽链吗？
看一些文章说upstream ORF会影响翻译。到底怎么一个影响法呢？
多谢讨论！ |
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j****x
发帖数: 1704 | 31 和原核mRNA不一样，真核mRNA的翻译并不遵守“第一AUG”原则，所以同一条mRNA翻译
出不同的产物很常见（即使不存在IRES的情况下），尤其在病毒编码的mRNA中更是普遍。
首先检查一下，你这2个AUG，是否都符合Kozak consensus规则，简言之如果-3位为A且
/或+4位为G的话，那么该AUG可用为翻译起始的可能性很大，这样的AUG如果在5'UTR 区
域中存在甚至还不止一个的话，那么自然对正常的ORF翻译有竞争性（核糖体）的副作
用了。这就是所谓upstream ORF的负效应。 |
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E****A
发帖数: 184 | 32 多谢你的见解。
刚才在wiki里看到你说的Kozak consensus是(gcc)gccRccAUGG，R可以是A也可以是G。
查了下两个AUG都符合。你说对正常的ORF有竞争性是指下游的ORF不会被翻译还是翻译
会变弱？
其实我刚开始的帖子里没有完全说出来，在1st exon和2nd exon中间有个alternative
first exon。这个alternative first exon所属的mRNA只有在2nd exon上有AUG，这个
2nd exon和上面那条mRNA的2nd exon是一样的。这么说，1st exon上的AUG会对这条
alternative 1st exon所属的mRNA的翻译产生抑制作用？有文章说明这种抑制作用的强
弱吗？
多谢。
遍。 |
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E****A
发帖数: 184 | 33 多谢！
RT-PCR和Northern blot验证了两条mRNA的存在。
看了楼上的PNAS文章，说uORFs correlate with significantly
reduced protein expression of the downstream ORF.
不知first exon的uORF会不会对alternative first exon的ORF产生啥影响或抑制作用
呢？ |
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E****A
发帖数: 184 | 34 多谢你的讨论！
1.我明白first exon和alternative first exon是由不同promoter产生的两条独立mRNA
，不过也
想知道彼此的orf会不会有影响。
2.我确实不确定first exon aug是uorf，不过只是第二个aug起始的orf是最早被克隆出
来当做
coding sequence的(跟human中的一样)，后来通过找est才发现的first exon和
alternative
first exon。mrna里确实有很多aug，不过只有这两个aug能被翻译啊。。
期待更多讨论和见解。
splicing |
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l**********k
发帖数: 189 | 35 如果是这样的话，又多了一种可能性。在mRNA上，不是所有情况下第一个ATG
都是起始密码子。前后的序列，比如Kozak序列，才是决定mRNA从哪里开始翻
译的起始位点。我怀疑还有一种可能性，因为你们破坏了A本身的ATG，Cre放
在了20bp之后。有可能Cre自己的ATG不能作为kozak或类似序列，所以，不能
被核糖体视为一个ORF的start codon，所以不能表达你的Cre。再往后面的
ATG, 即使有可能被视做一个ORF的起始密码字，也会造成移码（66％可能性）
或表达不完全。算作第E种可能性吧。
最简单的办法就是，把Cre放在后面的外显子里，可以用2A或IRES表达一个完整
的Cre蛋白，如果你不喜欢融合蛋白的话。分析原因毕竟不是你自己的课题。
愿你好运。 |
|
l**********k
发帖数: 189 | 36 从你的描述来看，你说能够检测到Cre mRNA（如果你的RT-PCR没有DNA的污染），
说明mRNA的转录没有问题（不知道是不是测的full-length)。如果是这样，说明没有
Cre 表达的确是蛋白翻译的问题。
不是所有的mRNA的ORF的ATG都有标准的Kozak结构，所以我说是Kozak或是类似
的结构能够让ATG做翻译起始密码子。有许多的基因的mRNA, 在其ORF的起始密码子
前面还会有一个或多个ATG，但它们并不是start codon。所以说核糖体结合mRNA后
遇到的第一个ATG并不一定是起始密码子。除了所谓的标准Kozak序列之外，肯定还
有其它机制让一个ATG成为起始密码子。这只不过是我自己的一点个人经验。十有八九
是错的。也希望别人能够回答。谢谢。
因为实在有点忙，所以可能不能及时回答您更多的问题了。抱歉。
|
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h**********r
发帖数: 671 | 37 在此拜过克隆达人，跪求葵花宝典。
我正好有个克隆要做，就是teminator-promoter-ORF-terminator.
一看酶切位点设计的正好是：
pUC19 (HindIII)-(HindIII)terminator(PstI)- (PstI)promoter (XbaI)- (XbaI)ORF(
KpnI)-(KpnI)terminator(EcoRI)- pUC19 (EcoRI)
片段都不大。
请问葡萄MM，我这个能crazy一把吗？我做克隆也是身经百战了。
直接切PCR产物就OK了吧？
多谢！
实验成功，必有包子酬谢！ |
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H****N
发帖数: 997 | 38 I just replaced the endogenous orf with my orf. |
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s******y
发帖数: 28562 | 39 老兄，你有没有helper transposase 啊？
我实在是找不到能在mammalian cells 里面用的helper, JHU 的 Nancy Craig 说因为她
做的那个质粒涉及到版权问题不能给别人用，而Notre Dame 的Malcolm J. Fraser主要是
做果蝇里面用的，他们的清单里（http://piggybac.bio.nd.edu/）
唯一一个貌似能够在mammalian cell 里面用的helper 是 p3xP3-DsRed1-orf （ The
CMV promoter driven piggyBac ORF helper plasmid. Also contains a 3xP3
controlled DsRed1 genetic maker）。
但是我们要转进去的蛋白正好也是红色的，我不知道这个helper 会不会把它自己的质
粒包括DsRed1 genetic maker 也一道stably转进去？如果也会的话那我们就不能用了！ |
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z****g
发帖数: 972 | 40 想知道yeast所有ORF(>5000个)里面哪些ORF序列含有某些特定的restriction site, 比
如说GGTACC，除了一个一个的查，有没有online工具可以用类似于blast这种方法的？
对了，已经试过yeastgenome.org里面的Annotate Restriction Sites，不工作。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 41 sunny 老大和 长木行 longwoodwalk 不熟吗 in 2008 or 09 ?
LZ please refer
同主题阅读：Re: 这样构建bac，可行不？
[版面:生物学][首篇作者：longwoodwalk] , 2011年06月04日23:37:27
[分页:1 ]
longwoodwalk
[ 2 ]
发信人: longwoodwalk (长木行走), 信区: Biology
标 题: Re: 这样构建bac，可行不？
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Jun 5 11:34:27 2011, 美东)
如果是这样的话，又多了一种可能性。在mRNA上，不是所有情况下第一个ATG
都是起始密码子。前后的序列，比如Kozak序列，才是决定mRNA从哪里开始翻
译的起始位点。我怀疑还有一种可能性，因为你们破坏了A本身的ATG，Cre放
在了20bp之后。有可能Cre自己的ATG不能作为kozak或类似序列，所以，不能
被核糖体视为一个ORF的start codon，所以不能表达你的Cre。再往后面的
ATG, 即使有可能被视做一个ORF的起始密码字，... 阅读全帖 |
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b******y
发帖数: 627 | 42 If you have a 50 a.a peptide with no particular 2nd structure, I call it a
peptide. Some polypeptides, like ww domains, have only about 40 a.a. (3
short beta strands packed in an antiparallel fashion), which can bind
proline-rich peptide ligands. I can call them proteins or at least protein
domains. I believe there are a few domains that are of comparable size or
even smaller than ww domains. Don't remember what they are called on top of
my head.
As we all know, it is so trivial to translate DNA... 阅读全帖 |
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S******e
发帖数: 393 | 43 在考虑做两个基因在同一个质粒的construct,所以想起来这个问题。
若把一个ORF后面的 SV40 PolyA 去掉（后面紧跟另一个CMV promoter + another ORF
），还会表达么，还是说有弱的表达？ |
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j****x
发帖数: 1704 | 44 事实上有不少商业载体都是这么干的，2个不同的Promoter+ORF串联，最后加上公用的
polyA signal，产生3' overlapping transcripts，比如invitrogen著名的pLenti
gateway系列。这种转录结构其实也不是人类原创了，而是从病毒那里学来的，最典型
的就是HBV，所有5个转录本，7个编码蛋白，共用唯一一个polyA site。
至于说表达水平，决定的因素有很多，但是最基本的一个原则是，两个串联应该使用不
用的promoter，否则很可能出现竞争性抑制。
ORF |
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l**********1
发帖数: 5204 | 45 if to alternative splcing 3'-end multi ployA sites plus that alternative
ORF length are so longer than superscript reverse transcriptase can cover
likes 20kb then only
one choice is use that oligo dt and Multiscibe reverse transcriptase
then PCR different fragment by diffeeernt forward and reverse primer pairs
set then sub-cloning then sequencing then assembly different fragment to
one super long ORF.
Multiscribe |
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l*******i
发帖数: 153 | 46 通过病人肿瘤组织的RNA-seq我们发现了一个新基因，最初老板认为只是个non-coding
RNA；但是我发现其有ORF。敲低这个基因，和过表达其ORF，发现其可能与肿瘤细胞的
migration有关。由于找不到任何与这个蛋白有相似序列/结构的基因，而且其本身也没
法预测诸如DNA-binding domain等功能域，所以也没法推测其可能是个转录因子还是啥
别的。
请各位给点建议，用怎样的手段筛这个基因的上下游target比较快速、可靠？真心谢过！ |
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c**********r
发帖数: 138 | 47 情商太低.
说实话，这里能有什么可说教的？三楼认为不去除融合蛋白后面那个ORF里的ATG算是一
个初级错误，我不认同而已。融合蛋白表达载体，无论商用还是文献中报道的，保留后
面ORF里ATG的........ |
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c****t
发帖数: 194 | 48 手头有一个大约150K bps的序列，除了NCBI在线分析ORF之外，大家都使用什么软件分
析？另外如何快速找到ORF的大概功能？
thanks |
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D***a
发帖数: 1616 | 49 麻烦大家帮我查些文献， 搞绿卡用的，这些文献不在google scholar里,谢谢，包子请
一次拿走
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/chem.201305021/full
或者点以上链接，再点citing literature
Number of times cited: 14
1Miriam M. Schwab, Daniel Himmel, Sylwia Kacprzak, Daniel Kratzert,
Valentin Radtke, Philippe Weis, Kallol Ray, Ernst-Wilhelm Scheidt, Wolfgang
Scherer, Bas de Bruin, Stefan Weber, Ingo Krossing, [Ni(cod)2][Al(ORF)4], a
Source for Naked Nickel(I) Chemistry, Angewandte Chemie International
Edition, 2015, n/aWiley Online Li... 阅读全帖 |
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