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V********n
发帖数: 305 | 2 嗯，如果是这样的话，H３是很好的marker。
俺还是觉得问题出在细胞裂解，不知道你镜下观测细胞核用的是什么染色。如果是直接
bind到DNA上的如DAPI之类，只要DNA不被降解，都可以染出来，无法提示你关于
fractionation的信息。
如果你还是相信你的操作，做个H３的IF看看。也许是重大发现？ |
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y*********1
发帖数: 46 | 3 What about doing western with anti-H3K4me3 antibodies? There are some very
good antibodies for both western and ChIP. |
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b**j
发帖数: 415 | 4 理论是可以，但一般paper里少有人用这个当marker |
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S******e
发帖数: 36 | 5 我曾经试过用不同的方法裂解细胞，比方说用低渗Buffer(10 mM HEPES (pH 7.9), 10
mM KCl, 1.5 mM MgCl2）溶胀细胞后，dounce 10次或者加1%NP40，每次我都用普通的
相差显微镜检查过细胞，溶胀后细胞膜没破，但Dounce或者加入NP40后，90%以上细胞
膜破掉，细胞核似乎还是完整的。可是当做WB时候，很多只在核内的蛋白（比方说转录
因子）都可以明显的在cyto的fraction里边检测到，我估计还是有渗漏。你能检测到H3
可能也是这个原因？ |
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c****g
发帖数: 93 | 7 我们用这个lysis buff：
10 mM HEPES/KOH, pH7.6
1.5mM MgCl 2
10 mM KCl
5 mM EDTA
5 mM EGTA
250 mM Sucrose
Adjust pH 7.6 with 10N KOH
然后过过15次#7 needle，低速离心后上清基本是cytosol，无nuclear protein。
10
H3 |
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n********k
发帖数: 2818 | 8 Just got some of my ChIP-seq data back:
For histone markers, looked great and the cores told me it is great above 70
% mappable reads and peak calling with FDR of <5%...
for my TF, the data make sense to me but the core said it is trash/useless,
9-20% mappable reads (out of 9-11M, meant to get 20M) and peaks calling with
a FDR of 100%.
Luckily my TF has been chipped many many time and has very conserved binding
sites. I randomly picked the mapped peaks, most of them with at least 1
high confid... 阅读全帖 |
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s******s
发帖数: 13035 | 9 never done mapping myself, but FYI
1. histone marker和TF的Chip-seq protocol应该非常不一样，不知道你是不是用的一
个protocol
2. hiseq现在一条lane大概200m reads, 50bp的话，略微不到40G的data.
70
,
with
binding |
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z***d
发帖数: 131 | 10 除了用histone各位点的修饰抗体一个一个用Western或ICC检测外，还有什么简单高效
的方法？
在一个cell line overexpress了一个蛋白（其功能已被公认为chromatin remodeling
protein，但具体不知其造成什么样的chromatin改变以及机制）。虽然不是我们
manuscript的重点，为了应付Reviewer的意见，不得不想法做几个试验，以自圆其说。
多谢啦！ |
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z***d
发帖数: 131 | 11 除了用histone各位点的修饰抗体一个一个用Western或ICC检测外，还有什么简单高效
的方法？
在一个cell line overexpress了一个蛋白（其功能已被公认为chromatin remodeling
protein，但具体不知其造成什么样的chromatin改变以及机制）。虽然不是我们
manuscript的重点，为了应付Reviewer的意见，不得不想法做几个试验，以自圆其说。
多谢啦！ |
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j*p
发帖数: 411 | 12 1. UCSC genome browser has many ChIP-seq tracks including TFs, Pol2 and
Histone modifications (H3K4me3, H3K27me3, H3K36me3, etc) on different cell
lines(through Encode/Gencode project). You can just active these tracks and
compare with what you have to see if your H3K4me3 data looks normal or not.
2. I suggest you normalize your ChIP-seq signals. For example, your normal
tissue ChIP-seq has total number mappable reads = 10M, your tumor sample has
20M mappable reads, then divide any signal from t... 阅读全帖 |
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n********k
发帖数: 2818 | 14 This is a smart, very focused and productive one I have heard from people
working with him...XD Wang's first student was even more impressive if I am not too old:) and several from HJ Song's lab also have impressive records, A and P from this board both have impressive records in pretty shoret time too...
BTW, to upbeat/Q a bit for those (including myself) who may feel depressed now)....Nothing particularly/unusually, Pretty much decent intelligence, strong motivations/working/person habits/... 阅读全帖 |
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m*******n
发帖数: 387 | 15 推测某个非histone的蛋白可能被甲基化
想用pan-methylation-K的抗体试试，当然是IP之后
求推荐一个比较好用的抗体
或者还有其他比较好的方法，证明某个蛋白可以被甲基化吗？ |
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x******m
发帖数: 736 | 16 比如某个500kb genomic region
只想看这个区域的H3Kme3，不想做genome-wide，所以不能用chip-seq。
有什么简单的方法吗？ |
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X***n
发帖数: 366 | 17 Agilent custom array. 100 bp per probe, you can tile your 500 kb with around
5000 probes. Then ChIP-on-chip.
★ Sent from iPhone App: iReader Mitbbs 7.28 - iPad Lite |
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b**********8
发帖数: 349 | 18 2. 由于蛋白A本身又可以和Histone H1竞争与Linker DNA binding, 有无可能所见到的
acetyl-H3K9在genes B promoter region处的结合率降低是由于高表达的蛋白A本身取
代了endogenous H3 和acetylated-H3?
这个还真有可能。很多蛋白不但调节其他转录因子，他本身也可以作为转录因子直接参
与调控靶基因转录。要不再用A蛋白的抗体做个ChIP试试？另外，你可以做个western看
看pan-acetyl-H3K9的水平有没有降低。
楼下继续。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 19 一般做histone的都能拿到很多DNA，nanodrop没啥问题。做TF的，
可能拿到的很少，nanodrop确实太不准
fail |
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m******5
发帖数: 1383 | 20 phorshpor Histon 3 is a common marker for mitosis phase
you can do a westernblot to find out
IHC also works |
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s******y
发帖数: 220 | 21 做western blot， 一般nuclear marker用histone或者Lamin B, cytosolic的呢？ 看
到有文献用的是RhoGDI, 这个不是常用的把？ 一般广泛接受的cytosolic marker用哪
个蛋白好呢？
谢谢。 |
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b*****d
发帖数: 67 | 22 那就大概说说？
据我艰难查到的一些资料， 好像是受精卵的染色体上的histone修饰， 让基因处于一
种没有分化表达的状态, 就是不会受到什么因子就开始表达。compact 后， 这种状态
被打破， 然后细胞开始分化？
不搞清楚都睡不好觉啊。 |
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f******h
发帖数: 40 | 23 正在写一篇综述，总觉得标题读起来很别扭，所以到这里来征求大家的意见。如果您的
意见触动了我的灵感，我便包子答谢。 |
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a*****x
发帖数: 901 | 24 不是很理解，Acetyltransferases为什么是Kinases的counterparts,都不是作用同样的
residue。。。 |
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s*********t
发帖数: 600 | 25 另外，第一次得到的上清和细胞核pellet，我们实验室还有人再次用低盐溶液洗涤一次
细胞核pellet。可是我试过一次，细胞用homogenizer捣过之后，再离心，得到的
pellet已经有黏糊糊的倾向了，是不是细胞核也破碎了？如果再次洗涤，我担心细胞核
蛋白会损失。所以我都不洗涤。
所以做western检测quality，总是发现CE里面也混有少量NE蛋白（anti Histone），NE
里面混有少量CE （anti GAPDH）。
所以我现在最烦做从大量细胞制备NE，S100的实验，因为跟文献的方法总是有些修改，不同的文献使用
的方法也不同，同个实验室，不同的人用的都不同，让我无所适从。 |
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s*********t
发帖数: 600 | 26 你说的QC assay是什么？
我做western检测NE和CE的quality，总是发现CE里面也混有少量NE蛋白（anti Histone
），NE
里面混有少量CE （anti GAPDH）。不过这些都是粗蛋白总蛋白，怎么进一步检测呢？
我担心的一是破碎细胞之后的细胞核pellet已经像鼻涕了，是不是细胞核也被弄破了？
然后NE和CE各自有少量互相污染。
二是透析会产生大量沉淀，直接稀释也会产生很多沉淀。也许你要研究的未知蛋白就在
这些沉淀里面呢 。。。
我查了n多文献，从80年代的方法到现在的，都不相同。同一个实验室，不同人各自的
做法也有差异。
无所适从啊。 |
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f*******e
发帖数: 354 | 27 我在想，除了破碎细胞，高盐低盐是不是对蛋白的释放有作用啊，可是细胞都破了，蛋
白还没有释放，就是不懂，为什么要搞透析这一步
Histone |
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C********4
发帖数: 308 | 28 这个epigenetics一点都不太数学呀 不过现在开始进入omics阶段,计算机也许需要些,
不过如果你不是专门做bioinformatics,那也不必担心
传统的大牛 就Danny Reinberg, Yi Zhang ,CD Allis 搜一些他们写的综述读读
要是想再多了解
Or Gozani@stanford, Xiaobing Shi滴老板
Timothy Bestor 做DNA甲基化
Jeannie Lee，X染色体失活
Jürg Müller@马普, Giacomo CAVALLI, Pirrotta 做polycomb
做植物的Steve Jacobsen, Jian-Kang Zhu
做histone variants的 Steve Henikoff, Genevieve Almouzni, Carl Wu
做干细胞的Rudolf Jaenisch
做omics的Keji Zhao, Richard Young
做DNA甲基化的Peter Jones, Adrian Bird, Wolf Reik, Azim Surani
做组蛋白修饰的Jerry Workman,... 阅读全帖 |
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C********4
发帖数: 308 | 29 这个epigenetics一点都不太数学呀 不过现在开始进入omics阶段,计算机也许需要些,
不过如果你不是专门做bioinformatics,那也不必担心
传统的大牛 就Danny Reinberg, Yi Zhang ,CD Allis 搜一些他们写的综述读读
要是想再多了解
Or Gozani@stanford, Xiaobing Shi滴老板
Timothy Bestor 做DNA甲基化
Jeannie Lee，X染色体失活
Jürg Müller@马普, Giacomo CAVALLI, Pirrotta 做polycomb
做植物的Steve Jacobsen, Jian-Kang Zhu
做histone variants的 Steve Henikoff, Genevieve Almouzni, Carl Wu
做干细胞的Rudolf Jaenisch
做omics的Keji Zhao, Richard Young
做DNA甲基化的Peter Jones, Adrian Bird, Wolf Reik, Azim Surani
做组蛋白修饰的Jerry Workman,... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 30 有的工程学的 年会
likes
The annual IEEE International Conference on Bioinformatics and Bioengineering
//bibe2011.asia.edu.tw/
提前半年 交会议发表/oral and poster both 的全文 manuscript
IMPORTANT DATES
Paper submission: April 22, 2011 May 6, 2011
经peer review后 决定是否给予在大会上的发言资格
Notification of acceptance: June 24, 2011
cited from
Tu-Bao Ho
Professor, School of Knowledge Science, JIAST
official links:
//www.jaist.ac.jp/~bao/
一越籍or日籍(possible) 华裔哦
//www.jaist.ac.jp/~bao/publicationbyyear.html
Le, N.T., Ho, T.B. (2011... 阅读全帖 |
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b******s
发帖数: 1089 | 31 我做了好几个不同的tag: YFP，CFP, mcherry等。用histone试全部有荧光，但连其他
蛋白的时候，偶尔有荧光，但很多都没有。蛋白和tag中间隔的是MCS，大约15aa的样子
。我看很多其他的载体还做了专门的亲水linker，是不是加了这样的linker大部分情况
下都好用，还是也要看不同蛋白的特性？ |
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s******a
发帖数: 252 | 32 So it's Barkai's student.
1 Science, 1 Nat Genetics.
That's outstanding but not surprising.
Publications:
Tsui K, Dubuis S, Gebbia M, Morse RH, Barkai N, Tirosh I, Nislow C (2011).
Evolution of nucleosome occupancy: conservation of global properties and
divergence of gene-specific patterns. Mol Cell Biol. 31:4348-55.
Dori-Bachash M, Shema E, Tirosh I (2011). Coupled evolution of transcription
and mRNA degradation. PLoS Biol. 9(7):e1001106.
Tirosh I, Barkai N (2011). Inferring regulatory mechani... 阅读全帖 |
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u**********d
发帖数: 573 | 34 nucleus可以用histone，lamin B
membrane没做过 |
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E*******2
发帖数: 131 | 35 如果是做histone的话，可以用MNase,做native chip |
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E*******2
发帖数: 131 | 36 如果是做histone的话，可以用MNase,做native chip |
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n********k
发帖数: 2818 | 38 ABCAM 前一阵子好像刚出了一表，非常详尽， |
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n********k
发帖数: 2818 | 39 对了，你不是要做一个所有的大库吧，那牛大发了，发布前要先通知我呀！ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 41 here you go,
//www.abcam.com/ps/pdf/chromatin/Histone_Marks_H3_&_H2A.pdf
//www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11033&pid=5
//www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=13452&source=pagetrap&
viapagetrap=panels
N院士和matrix 都选了同一web link 啊 hereby deleted it from already shown
lower floor,.. Lol
//www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=14855&utm_campaign=CFA-
Chromatin&utm_source=Abcam.CFA&utm_medium=Email&utm_term=JuneCharomatin-
EpiModposteremailbody&cl=250&intGoUser=... 阅读全帖 |
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l********s
发帖数: 70 | 43 我做的是tissue，至于具体多少细胞不敢确定，只能用input 来确定。 我觉得应该有
binding区域吧，histone的，很global的。 谢谢，
我是500ul lysis buffer 后 sonication，
然后吸出100ul lysate 再加900ul dilution buffer。
用agarose G洗过后，从1000ul 里抽出100ul 做IP， 100 做IgG 100做target。 别的
保存，不知道这样行吗？谢谢 |
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k*****n
发帖数: 323 | 44 it is pretty low for regular histone ChIP.
anyway, it is hard to give you suggestion without the number of cell~ |
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O******e
发帖数: 4845 | 45 那不是 NGS 。。。。
而且epigenetics还包括histone modifications ... |
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p*******s
发帖数: 516 | 46 ppl are doing it using NGS. We once had a visitor in that field.
Agree that histone modifications are not covered. |
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u**********d
发帖数: 573 | 47 chromosome必须是指一条完整的DNA分子，比如人有46条染色体。DNA不是裸露的，和
histone还有其它相关蛋白包装成在一起，叫chromatin，所以chromosome是由
chromatin组成的。对chromosome最直观的了解来自于细胞分裂的时候，chromatin凝聚
成一个个的小棒棒。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 48 LZ 要找个mentor lab 问下对方 啦
比如 Fan GP of UCLA:
Fouse, S. et al. and Fan, G. (2008)
Promoter CpG methylation contributes to ES cell gene regulation in parallel
with Oct4/Nanog, PcG complex, and histone H3 K4/K27 trimethylation..
Cell Stem Cell 2: 160-169.
//faculty.bri.ucla.edu/institution/personnel?personnel_id=45766
and his group one N sister paper about DKO mice strain:
Feng J et al. and Fan G. (2010)
Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in
adult forebrain ne... 阅读全帖 |
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h***l
发帖数: 168 | 49 Hiroshi Kimura developed some nice Fab antibodies to monitor histone
modifications in live cells - for example:
Nucleic Acids Res. 2011 Aug;39(15):6475-88
Not whole organism level, yet... |
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t*d
发帖数: 1290 | 50 多谢。
今天看了一片zhang yi 的老综述。这个 histone marker 怎么在细胞分裂是被复制的
机理还不是很清楚。
里面提到 H3/H4 dimer 可能比 H3/H4 tetramer 更稳定。这个倒是个好的蛮好的解释
。可惜被证伪了。 |
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