V***b
发帖数: 3419 | 1 做nucleus/cytoplasm fractionation。我现在用lamin A/C做nuclear marker。有些人
用lamin B或者histone。用什么最好呢？细胞质我用tubulin，有人用b-actin，但我脑
子里的印象actin在胞质/胞核都有吧？我现在做几个转录因子，在胞质/胞核之间跑来
跑去的，想找比较理想客观的marker。有经验的同学给说说。 |
|
|
R******d
发帖数: 1436 | 3 很多文献都说组蛋白修饰和基因表达水平有关。是不是有两种可能的机理：
1，修饰后的组蛋白直接招募转录因子，或者驱赶转录因子，启动或者中止转录。
2，修饰后的组蛋白和nucleosome/chromatin remodeling蛋白复合体结合，导致染色体
结构开放
或关闭。从而利于或者抑制转录。
请问1和2哪个正确？可否给点支持文献。
非本专业，请不吝赐教，包子酬谢。 |
|
n******u
发帖数: 418 | 4 对于acetylation，是第二个情况
其余的modification不了解 |
|
c********r
发帖数: 189 | 5 可以在UCSC中查一下这段序列histone marker是什么 |
|
s******s
发帖数: 13035 | 6 去查一下histone的文章或者lab, 这个应该都是你说的那种 |
|
s******y
发帖数: 28562 | 7 Histone 是碱性蛋白，所以可以用比较常用的acetic acid-urea PAGE.
我们的蛋白是酸性的，不能用他们的配方。 |
|
y******8
发帖数: 1764 | 8 http://www.bio.pku.edu.cn/exchange/index.jsp
Chengqi Yi, Ph.D 主讲 Probing the Biology of Nucleic A
11:00 - 12:00, May. 19, 2011, Thu. 北大新生物楼517会议室
Suhua Feng, Ph.D 主讲 Studying DNA methylation in Eukaryotic Organisms
09:00 - 10:00, May. 19, 2011, Thu. 北大新生物楼517会议室
YuHang Chen, Ph.D 主讲 Exploring ion channels by crystallography and
electrophysiology
08:00 - 09:00, May. 19, 2011, Thu. 北大新生物楼517会议室
Xiang Yang, Ph.D 主讲 Novel Photoreception in Drosophila Larval Body Wall:
from Molecules to Behavior
10:0... 阅读全帖 |
|
|
|
|
c******r
发帖数: 3778 | 12 这个问题有意思。我不是很清楚二者的关系。我个人的理解，二者有点像与门电路，而
没有直接的因果关系。二者的调控好像是独立的。虽然可以互相interact，但是并非一
导致二这样。
不知道我理解的对不对？ |
|
l******o
发帖数: 3764 | 13 1.if high blood cholesterol/glucose level can change the epigenetic pattern
of somatic cells--i.e. up/down regulates methylation or histone modification
, I think it is also possible to change that of germ cells to some extent.
2.not quite understand what you mean...
3.as joyhead said, I tend to view epigenetics as a part of gene expression
regulation, and also epigentic chances as quantitative rather than
qualitative traits. In another word, changes are subtle. So I don't see why
it would viola... 阅读全帖 |
|
g*********d
发帖数: 233 | 14 夏荣辉，李江
上海交通大学医学院，上海（200011）
E-mail：e******[email protected]
摘 要：基因的表观遗传学修饰正越来越受到人们的重视，它包括DNA甲基化和组蛋白修
饰，组蛋白修
饰又包括组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化。基因的表观遗传学改变在基因转录调节方面有
重要作用。最
近研究较多的是多种组蛋白修饰方式和DNA甲基化在基因转录调节方面的共同作用，本
文详述组蛋白
修饰和DNA甲基化的发生机制，并且总结了组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化与DNA甲基化之
间的相互作
用，提示不同位点的组蛋白甲基化与DNA甲基化共同作用于基因转录，并且发挥不同的
作用，具体体
现在组蛋白乙酰化、组蛋白H3K9、H3K27和H4K20甲基化与DNA甲基化协同作用，使基因
发生转录抑
制，而组蛋白H3K4甲基化与基因转录激活有关。
关键词：组蛋白修饰；DNA甲基化；关系
1. 引 言
目前，在研究肿瘤发生发展的过程中，基因的表观遗传学修饰所起的作用日益得到人们
的重视。组蛋
白修饰和DNA甲基化是两种最重要的表观遗传学修饰方式。研究表明，人类几乎所有类
型的肿瘤都存
在组蛋白及DNA甲基化的异常... 阅读全帖 |
|
g*********d
发帖数: 233 | 15 Box 1. Properties of euchromatic and heterochromatic regions
Trying to define heterochromatin is like trying to define life itself: a
cluster of important properties can be specified, but there are exceptions
in every instance. For example, centromeres are usually associated with
blocks of flanking heterochromatin. However, the inner centromere of
Drosophila chromosomes is associated with blocks of nucleosomes that contain
CENP-A (also known as CID), a variant of histone H3, interspersed with
bl... 阅读全帖 |
|
n******2
发帖数: 971 | 16 1、如何判断DNA-Protein 被over cross linking 还是under cross linking？
2、在sonication的优化过程中，0次sonication的DNA 总是有smear。我用的是MCF7
cell line，第一步就用1% Formaldehyde固定，然后大体是harvest=>lysis=>sonicate
=>reverse=>proteanaseK=>DNA purification。DNA降解最可能会在哪一步呢？
3、如果用histone检验实验体系，如何选择DNA binding region?
谢了。 |
|
k*****n
发帖数: 323 | 17 1：1% formaldehyde crosslink 10-20min 应该都不会有太大问题。
2：理论上dna哪一步都不会降解。除非你有dnase的污染。
3：单纯的histone不是很好的检验体系，你可以用polii和h3k4me3或者h3ac的抗体做系
统的阳性对照。 |
|
m******5
发帖数: 1383 | 18 google N-chip和X-chip
两种不同的方法
用酶digest的非特异性binding少，并且因为去掉了cross linking的步骤，能用的抗体
数大大增加。缺点是很难拿到transcriptional factor和特定片断的binding 。做
Histon的人应该用得多些，但因为没有cross linking，也会引入很多非特异性的
nucleosome remodeling。
用sonication 以及cross linking配合的方法好处是拿到的相互作用理论上说更接近生
理条件，但因为引入了固定这个过程，也导致许多artificial 作用， 比如蛋白质，
DNA间非功能性的相互作用 |
|
d****7
发帖数: 109 | 19 这个问题我也不确定，以下是我的一些拙见，如有错误，欢迎指出：
现在一般有两种normalization方法：%Input和fold enrichment.
我觉得两种都非常重要，简要来说，fold enrichment是衡量你所看得区域是否是bona
fide target的标准，而%Input给你一个大概的概念，看binding强不强，很多人说（我
也不确定）一般TF的强度在0.01%-1%，而hitone神马的都很强(2%以上？)。
Biogene同学说:“0.01%几乎与IgG的信号差不多了，这时候很难确定真实TF binding信
号，还是背景，还怎么算fold enrichment？”
对于这一点，其实不一定，normal IgG信号的强度真不好说，我现在也不知道IgG的信
号跟什么有关，可能不同公司的normal IgG不同，不同IP buffer得到的IgG信号不同，
不同wash buffer得到的信号也不同，比如大家看这篇nature文章，通篇的ChIP信号都
是0.0001%数量级的：
http://www.nature.com/nature/journal/v47... 阅读全帖 |
|
q****2
发帖数: 208 | 20 网上找了半天，只有H3K9ac／s10p和H3K14ac／S10p的抗体，想知道还有没有同时可以
识别三个modification的抗体 比如说H3K4me3／K14ac／S10p抗体，或者两个H3K4me3／
K14ac的抗体，有没有人用过么？ 不知道是我关键词用的不对还是其他什么原因。 也
没有找到文章。 多谢了 |
|
s**x
发帖数: 138 | 21 i am going to pull down acetyl-h3k9. is it necessary or required to use
Histone deacetylase inhibitor NAM+TSA??? |
|
G******0
发帖数: 737 | 22 有关epigenetics的review里的图histone和DNA画的都很漂亮, 有没有什么软件可用? |
|
e*****t
发帖数: 642 | 23 做histone marker和这个不矛盾。现代生物学就是bench和计算相结合。你要找任何生
物现象的相关性，就得用统计模型，就像QTL 对gene mapping的贡献。有种你发
genomic paper，不用任何统计方法，能发的出去，我就佩服。 |
|
m******5
发帖数: 1383 | 24 I found some claimed to be 'Chip qualified' antibody naturally gave out
super strong background (when using non transfected or knock out cell line
as negative control), maybe due to non specific binding to DNA or Histon?
I start to wonder if those paper simply use IgG as negative control
really got validated result. |
|
d****7
发帖数: 109 | 25 check these two cell papers:
Quantitative Interaction Proteomics and Genome-wide Profiling of Epigenetic
Histone Marks and Their Readers
SHREC, an effector complex for heterochromatic transcriptional silencing |
|
d****7
发帖数: 109 | 26 IgG本来就不是什么好的control，我们做ChIP时，不仅用IgG，还用negative region
primer做control
对于ChIP下来的DNA，这个跟你的蛋白的表达量，IP的细胞数有关，比如我的TF表达量
很低，我用20碟10cm dish才ChIP下来10ng DNA，如果是histone的话，估计会很多。
对于Protein G，我这有个鼠单抗，是IgG1，与protein G结合的一点也不好，必须用另
一种beads，叫Pan Mouse IgG Dynabeads，这个beads是pre-conjugated human
monoclonal ab to mouse IgG，结合的不错。但让我费解的是，同样是鼠单抗，同样是
IgG1，Flag M2抗体就和Protein G能perfectly结合。
Rabbit |
|
a****o
发帖数: 1786 | 27 WB好的抗体 ChIP未必好
Histone的抗体UpState的很好， 很多可用于ChIP
如果MammalianCells，10分钟应该够了
你用的抗体如果文献中没人用过，可能是抗体的问题
你选的DNA区域，你确信一定有差异吗？
如果IP下来的DNA太少，Ct值太高也不可靠
异, |
|
a**********s
发帖数: 8 | 28 说下自己的经验
首先建议用millipore（就是upstate，他们的histone antibody挺好用）的antibodies。
但现在不一定是antibodies的问题，有没有已知的某些gene promoter区域会有你要看
的transcription factor的binding site？你可以先看看在那些区域有没有positive的
binding，这样就可以大致判断你的IP是不是成功的。 |
|
e******n
发帖数: 2 | 29 招聘行政助理、生物信息研究助理和博士后
清华大学医学院干细胞及表观遗传研究室 (August, 2011)
本实验室主要研究表观遗传调控机制在干细胞多能性、动物生长发育和癌变中的作用。
课题组研究背景：
http://www.tsinghua.edu.cn/publish/med/3157/2010/20101215191338
拟招聘实验室行政助理、生物信息研究助理和博士后各1 名。待遇参照清华大学标准，
提供有竞争力的薪酬（具体视个人情况而定）。
一、实验室行政助理1名：
工作职责：
1、协助管理实验室的日常运转，包括试剂、耗材和仪器订购及报修，各类文档和数据
的管理和备案;
2、 处理相关办公室事宜，包括科研经费管理、年度报告和学生工作。
3、辅助完成简单的生物学实验 （optional）。
资格要求：
1、 本科以上学历，年龄不限；具有生物、生物信息、计算机背景者优先;
2、 有较好的计算机操作能力、中文写作和打字能力; 较好的英语水平；
3、 具有较好的管理能力，善于沟通和交流，具有团队合作精神;
4、 具有极强的责任心，工作主动积极，办事利落、... 阅读全帖 |
|
i*****g
发帖数: 11893 | 30 很有意思，看见这么多人在说这个想法。
这个想法我在2005年1月之前，换实验室时，和PI说了，他听不懂这张PPT意味什么。
后来我又换了实验室，2007年（2008？）某天新老板和我听完某个不相关的seminar，
和我说起这个，他才开口说了2句，我就知道他想说什么，
他的反应是，i have not finished my briefing yet, you really understand my
point? 于是就和他说，of course i know what you want to do,然后讨论了半天，原
来他的朋友有这个想法 etc etc，后来我又做了一些Homework，还是决定放弃。这个很
不好做，估计是个死途。
这个技术最大意义是：能找到locus specific DNA-protein complexes。目前的通行做
法是，已知某个protein, 你用CHIP，证明在某个Locus上面，然后开始making story，
编剧。但其实，那个Locus上面可能有几十种特殊蛋白在调控！！！
2004年底，我的想法来源于推广TAP+MS，我已知 TAP+MS... 阅读全帖 |
|
i*****g
发帖数: 11893 | 31 我觉得，玩技术突破不是不可以做，
比如那个哈佛的yang shi，做histone demethylation的，就是靠TAP+ms，弄到一个新
蛋白
但是，我认为主流是玩story，making sexy story是主流,
functional study & disease
弄这些技术，突破，是次流，很容易辛苦很久，也没有什么特别的功能
这个没有办法，就类似：你认为美国股市应该崩溃，但大佬们不认为
人在江湖，生存第一 |
|
c***o
发帖数: 35 | 32 说的是那些大家都知道其重要性，但相当长时间一直没有找到的，介导某一个狠重要生
物功能的，其发现以后对本领域能产生重大影响的蛋白分子。最近的例子包括：
1. MCU mitochondiral uniporter (2011 Mootha et al.)
2. PYLs as ABA receptor (2009 Cutler et al.)
3. HIF hydroxylases as O2 sensors (2001 Kaelin et al.)
4. LSD/JMJD enzymes as histone demethylases (2004 Shi et al.)
5. Orail channels as CRAC (2006 Rao et al.)
6. TET enzymes as 5mC hydroxylase (2009 Rao et al.)
7. Piezo as mechanosensory channels (2010 Patapoutian et al.)
看看这些original的发现历史和来龙去脉很有启发性（虽然很多其他发现比如microRNA
是完全出乎意... 阅读全帖 |
|
c***o
发帖数: 35 | 33 说的是那些大家都知道其重要性，但相当长时间一直没有找到的，介导某一个狠重要生
物功能的，其发现以后对本领域能产生重大影响的蛋白分子。最近的例子包括：
1. MCU mitochondiral uniporter (2011 Mootha et al.)
2. PYLs as ABA receptor (2009 Cutler et al.)
3. HIF hydroxylases as O2 sensors (2001 Kaelin et al.)
4. LSD/JMJD enzymes as histone demethylases (2004 Shi et al.)
5. Orail channels as CRAC (2006 Rao et al.)
6. TET enzymes as 5mC hydroxylase (2009 Rao et al.)
7. Piezo as mechanosensory channels (2010 Patapoutian et al.)
看看这些original的发现历史和来龙去脉很有启发性（虽然很多其他发现比如microRNA
是完全出乎意... 阅读全帖 |
|
e*****t
发帖数: 642 | 34 gao ren bu gan
sequencing the whole genome, you could get SNP (for GWAS, linkage analysis).
You could have genetic structure variation, like CNV.
sequencing the mRNA, you will have gene expression data, which could be used
for transcriptome analysis, or eQTL mapping.
Chip-seq gives you DNA-binding proteins analysis, like TF, histone
modification.
bisulfite sequencing give you DNA methylation, which has high correlation
with gene expression. |
|
|
s******s
发帖数: 13035 | 36 我没做过。不过比如nucleosome depletion, polII binding， histone marks, etc |
|
t**********8
发帖数: 223 | 37 我用H2A和 H2AZ做过，大部分是在nuclear。 你的lysis buffer 用的不对？ |
|
c********r
发帖数: 189 | 38
Lysis buffer 绝对是对的，我用了好几种，而且都在显微镜下观察了。老是在
cytoplasmic fraction 一大堆的H3，太让我伤心了~ |
|
|
V********n
发帖数: 305 | 40 H3在cyto里检测到是有可能的，但如果cyto里多，就不太对了。H3应该和DNA结合很牢
，其实并不是一个很好的Nu. marker，因为可能会造成分离假象 --- cyto fraction被
Nu protein轻微污染，但无法检测到H3。
不知道LZ如何用镜检确定的细胞fractionation。cyto里面有H3，首要怀疑的还是裂解
过程出错，buffer或者操作。
不急，慢慢来。 |
|
|
V********n
发帖数: 305 | 42 嗯，如果是这样的话，H３是很好的marker。
俺还是觉得问题出在细胞裂解，不知道你镜下观测细胞核用的是什么染色。如果是直接
bind到DNA上的如DAPI之类，只要DNA不被降解，都可以染出来，无法提示你关于
fractionation的信息。
如果你还是相信你的操作，做个H３的IF看看。也许是重大发现？ |
|
y*********1
发帖数: 46 | 43 What about doing western with anti-H3K4me3 antibodies? There are some very
good antibodies for both western and ChIP. |
|
b**j
发帖数: 415 | 44 理论是可以，但一般paper里少有人用这个当marker |
|
S******e
发帖数: 36 | 45 我曾经试过用不同的方法裂解细胞，比方说用低渗Buffer(10 mM HEPES (pH 7.9), 10
mM KCl, 1.5 mM MgCl2）溶胀细胞后，dounce 10次或者加1%NP40，每次我都用普通的
相差显微镜检查过细胞，溶胀后细胞膜没破，但Dounce或者加入NP40后，90%以上细胞
膜破掉，细胞核似乎还是完整的。可是当做WB时候，很多只在核内的蛋白（比方说转录
因子）都可以明显的在cyto的fraction里边检测到，我估计还是有渗漏。你能检测到H3
可能也是这个原因？ |
|
|
t**********8
发帖数: 223 | 47 我用H2A和 H2AZ做过，大部分是在nuclear。 你的lysis buffer 用的不对？ |
|
c********r
发帖数: 189 | 48
Lysis buffer 绝对是对的，我用了好几种，而且都在显微镜下观察了。老是在
cytoplasmic fraction 一大堆的H3，太让我伤心了~ |
|
|
V********n
发帖数: 305 | 50 H3在cyto里检测到是有可能的，但如果cyto里多，就不太对了。H3应该和DNA结合很牢
，其实并不是一个很好的Nu. marker，因为可能会造成分离假象 --- cyto fraction被
Nu protein轻微污染，但无法检测到H3。
不知道LZ如何用镜检确定的细胞fractionation。cyto里面有H3，首要怀疑的还是裂解
过程出错，buffer或者操作。
不急，慢慢来。 |
|
