k*******s
发帖数: 214 | 1 需要从gDNA上PCR尽可能长的片段，20Kb以上最好。请高人推荐几个公司的酶试试。另
外2个问题：
1. PCR最长能得到多长片段？我看到Fermentas的long 片段的，可以得到47kb,可信么？
2. 长片段PCR的是否有什么特别要求，比如引物设计。
谢谢。 |
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r**z
发帖数: 37 | 2 knockin还真没见过有人用gDNA的，能给个例子吗？谢谢
exon |
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G*****h
发帖数: 320 | 3 2-kb with 44% GC should not be too difficult. Below are what I can think of
at the moment:
1) There may be a very difficult secondary structure in the sequence (such
as an inverted repeat). If there is
indeed an inverted repeat, you have to run two separate PCR and then ligate
your two product together.
2) Some other secondary structure problems can be resolved by designing
longer primers, so you can have a
higher annealing temperature to overcome the problem.
3) Your template DNA is degraded, s... 阅读全帖 |
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r******y
发帖数: 21907 | 4 我现在需要把promoter和gene CDS克隆到一起。我先是分别克隆promoter and gene
CDS，然后pcr clean-up后把两者混合起来再分别用promoter的forward primer + gene
reverse primer做pcr，可是TA cloning后总不对，跑胶后看到合适大小的带也很弱，
我的pcr混合产物作了1:10 dilution。gene CDS is around 3.5 kb, promoter is 1.5
kb.是不是太长了？请指教！如果用gDNA序列太大了，以后也不好做。。。-- |
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r******y
发帖数: 21907 | 5 这个你用的片断也大吧 很多是那种整个gDNA的连接，我这个还算短片断 40应该够了吧？ |
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k*******s
发帖数: 214 | 6 无论pyrosequencing 还是NGS，得到的数据都是整个基因组的信息，不是你想要的rDNA
序列。很浪费。
一个可行的办法，就是用PCR，直接PCR全长的rDNA,模板是样品直接提取的gDNA (粪便
样品），然后做subcloning，就可以分析。可能要测很多序列，比如几万个。优点是序
列干净，可靠，全长 |
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p********t
发帖数: 3639 | 7 大多时间都automation真的就是他们的广告！
chemistry part步骤真是烦琐，因为我们的starting material很少，不是gDNA,所以先
要amplify targeted amplicons,再make template pool, 接着做fragmentation,add
adapter, PCR, 还有size selection, 每一步都要beads purification!
从FUSION PCR开始才能用one touch, 而且从one touch 到PGM都不能high high
throughput, 一天最多做两个样品，而且PGM的initiation也很花时间，做完2个样品或
者12个小时不用就要wash,所有的buffer都要求是当天新鲜配置的。
还有就是更新太快，316chip还木有用完，318又刚RELEASE了。。。。。。。。。。。。
不过结果还是不错的！ |
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k*********7
发帖数: 49 | 8 最近小弟我需要从较少细胞量（~1000）中提取genomic DNA，但是由于细胞量不多，始
终找不到很好的裂解提取的方法。
希望看到的高手可以教一下哈。
具体情况是这样的：材料是细胞，不是组织。不想使用kit，想自己配置一些裂解液，
比如tris-HCL，SDS，EDTA等，但是不清楚比例啊，加入裂解液后又该如何处理，比如
温度啊什么的。
求救啊，万分感谢，有知道的同学可以留言，也可以给我发邮件。
Thanks |
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M**a
发帖数: 4816 | 11 check your PM box.
Good luck! |
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s******s
发帖数: 13035 | 13 花钱买吧，也就几百刀。从CDNA里面批太痛苦了，还有一堆mutation.
如果是gDNA也就忍了 |
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h*****9
发帖数: 4028 | 14 个人谨慎的猜测你PCR/real-time PCR检测的是质粒的gDNA=cDNA。一个有control没有,
差别上千倍不稀罕。建议测序质粒看看有无错误或者做一个non-RT control。 |
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a***y
发帖数: 19743 | 15 如果是gDNA没有除干净。不需要在hood里也做得出来
如果是plasmid污染……我还没有遇到过。别人出来解答吧。 |
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s*****a
发帖数: 59 | 16 如果gDNA除干净了，是不是RT minus 的Ct>40？just curious.. |
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s*****a
发帖数: 59 | 17 恩，isoform 1的primer是intron spanning的，所以不会扩增gDNA，但是会被用来做
cloning的plasmid污染。我现在已经准备换掉全套实验用具了，还有换别的实验室做。
当然 |
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s******s
发帖数: 13035 | 18 不能用cDNA啊，你一个突变导致表达量降低，你啥也测不出啊。
都是测gDNA的。
么？
没有 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 19 Sure
Sampling Tumor gDNA can not satisfied
Illumina high density SNP arrays while it below 5 ng even from 2015
now 2010 is 200 ng one sample
pls refer:
We also routinely run the high density array technique to genotype up to 1
million snps per subject. The available platform is from Illumina and is
able to generate genotypes for up 300-750 subjects per week depending on the
type of array chosen.
Required material 200 ng DNA per sample
Reaction format 96 wells
Detection machine iScan b... 阅读全帖 |
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s******s
发帖数: 13035 | 20 你试一下column based的方法抽gDNA吧。我怀疑是不是蛋白没除尽，或者
有phenol残余。
did
not |
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w********r
发帖数: 1431 | 21 细胞数目大概一样就可以。固定超声之后都取1%的whole cell extract提gDNA，可以测
DNA浓度。剩下的细胞做ChIP，完了以后算IP下来的DNA里，target sequence是1%Input
的多少倍，再根据ctrl IgG算enrichment fold |
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j*****q
发帖数: 82 | 22 偶是定量copy number，用的直接是gDNA做template。所以没有intron的问题。
而且做的相对定量，所以底物的量不是问题，底物会有一个剃度的。
还是谢谢阳光jj的回帖。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 23 NCBI的primer tool里一试便知
www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/Share
最近集中设计了几十对类似引物，我的感觉是，想整出没有非特异性结合/扩增的gDNA
primer，那几乎就是不可能啊 |
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j*****q
发帖数: 82 | 24
gDNA
这个能用已有的primer pair来找在template上的非特异性结合？
可是偶的template还没有全基因组序列呢。不是human，也不是mouse。
其实有特异性结合扩增问题不大的，因为probe也是specific的。 |
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G*****h
发帖数: 320 | 25 如果primers 的特异性很好，没有杂带，没有intons，那么很可能就是target gene 本
身的拷贝数就很低。
如果物种的 genome 已经测序过的，可以看看这个基因的拷贝数。也可以算一下一个细
胞的 DNA 大概是多少 DNA，然后算算你放进去的DNA的量可以折算成几个拷贝。
一般1个bp 大概 10^(-9) pg。1 Mb gDNA ～1 fg。如果一套基因组大小是 1 GB，那么
～1000 fg ＝ ～1 pg。如果你放了 10 ng，单拷贝的基因就是 10^4 拷贝。
当然 genome PCR 的条件也需要 optimized。比如先要 95 C denature 5 min，前面的
一些 cycles 的annealing 和 extension 的时间长些，等等。
再就是根据你 amplify plasmid的结果（slope），看看你的 PCR amplification 的
efficiency。如果 efficiency 很低，那么大genome 里面的低拷贝的基因就更需要多
个 cycles。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 26 “但是拿到基因组DNA上扩增就很差。 不同的底物浓度的ct值
很接近，而且都偏大”
——除了上面这么多id说的，
另外还有一个情况要注意，gDNA提取过程中很多时候会带有PCR inhibitor
有的是样品带来的（比如environmental sample可能含humic acids， polyphenols
），有的是提纯过程中引入的（比如EtOH去的不干净之类的）
所以不是模板越多就越该P出来的
很多时候稀释模板以后反而能够P出来就是这个道理
因为稀释的时候PCR inhibitor也被稀释了
你这个“不同第五浓度Ct值很接近，而且都偏大”可能就是这个因素 |
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b****r
发帖数: 17995 | 27 这个真叫做胡扯
我们这作为世界顶级遗传系，一个月上百个exome的测序结果诊断疑似遗传病， 目前结
果是70%以上连受试者到底有没有疾病都看不出来，更别说根据基因组判断一个受精卵
能不能发育了。而且还是做的单细胞，测序覆盖率不可能比普通gDNA更好
而且胚胎是否着床是否发育，起码就现在的知识看，根本是无法判断的，例外也就是遗
传病患者做第三代试管婴儿这种只占一小部分的情况。
而且就是在自然界中，最健康自然的受孕方式，也只有1/3不到的机会，一对正常男女
能在一个月经周期受孕。胚胎发育极其复杂，时间又长，成功率低一点很可能是不可避
免的除错步骤，受精卵甚至极体阶段可能根本提供不了什么信息。
鄙视谢晓亮，吹牛也不害臊。 |
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m**********2
发帖数: 6568 | 28 the ones below are culturable strains. With "freeze dried".
The first one is gDNA.
1xTE
7cSalmonella+
Typhimurium, |
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D**R
发帖数: 371 | 29 多谢楼上两位，我倒也不是追究NanoDrop的准确性，关键是有两个(2/30)samples给了
两个实在是非常漂亮的peak at OD260，但是qPCR啥也没有，那种低得都测不准的
samples反倒是出来amplification了，所以我很困惑那么高的band到底是什么东西，
bioanalyzer也ran一下，觉得可能有些gDNA和RNA降解了，但关键这一批samples来自同
一个site，ralative speaking，这么高的peak会是从哪里来的。 |
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n**********u
发帖数: 77 | 30 美国大地现在都还是沉沉入睡的时刻，悠闲的中国周日下午也很少人有机会翻墙看看有
关学术争议的回复。 没想到我在香港尽然能够第一个回复。 不清楚这个方面的研究，
上下文也不清楚，但是楼主对待科学的态度还是很认真的，至少从国内申请奖项的态度
上楼主的实验室还是保守的。这种前沿问题还没有完全明晰之前，还是保守低调一些为
好，数据和实践是最好的评审，楼主一直用这样一个态度去做会成功的。 我只有做过
qpcr， 针对gDNA的，raw CT data和背景值这些放上去有用吗，单纯的数据摆上去我想
也很少有人关心吧，我也可能没有这方面的经验而看不懂（对照的就是背景值吗？
under detection 不就行了）。检测的可信范围这个我想实验组的量比内参的高的话，
应该就可行了吧。 |
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a********k
发帖数: 2273 | 31 想室温保存一年，然后用细胞悬液直接提gDNA。很多公司卖buffer,不知道有没有简单
点的配方？比如加个稀释的Lysis buffer之类的。
谢谢了。 |
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w*********3
发帖数: 217 | 32 试试promega的那个
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.6 |
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y*****u
发帖数: 31 | 34 因为要从同一组织同时提RNA和DNA.而且组织运来时已经在TRIZOL里面了。 |
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j*****9
发帖数: 716 | 35 用 Qiagen的 AllPrep DNA/RNA/Protein kit，DNA和RNA非常好，个人经验蛋白倒是很
差。 |
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y*****u
发帖数: 31 | 36 现在所有的样品都已经在TRIZOL里面寄来的。无法使用Qiagen家的KIT了，是否有生化
方面的专家能帮我分析一下我目前打算采取的步骤是否合理呢？ |
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Z******5
发帖数: 435 | 37 曾经尝试用Trizol同时分离过cell line的RNA和蛋白质，感觉根本不靠谱。 后来还是
平行做两盘，一盘只提RNA，一盘做蛋白，方便快捷又保险。 |
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h*******o
发帖数: 4884 | 38 trizol做RNA和DNA还行，protein那个做出来，不加SDS根本没法溶，加了SDS 跑出来的
胶跟鬼画符一样
DNA 我以前用trizol做没什么问题
就是干的时候不能太久，如果容不了可以加NaOH 去溶 |
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s****s
发帖数: 16 | 39 实验碰到难题了。最近从原代细胞里提取了genomic DNA，在agarose（ETBR）胶上可以
看到很清楚的band。然后用新购买的Qiagen的Epitech Bilsulte kit作bisulite
treatment。gDNA的input量是2 ug。 一切按照protocol做和DNA clean和column收集。
260／280 ratio 是2左右。但是到最后跑胶（200ng），什么都没有见到。做了几次，
都是这样。犹豫是否继续下一步的PCR。请有经验的大侠帮trouble shooting一下。不
胜感激。 |
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x********e
发帖数: 35261 | 40 PCR是要看基因的吧，不是每个基因都好p，特别是gDNA |
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y*****0
发帖数: 15 | 41 已经试过DMSO了，没有什么帮助。也听说betain对GC rich的gDNA PCR有帮助，正准备
试试。其实这个PCR还真不是一般的PCR，是用CRISPR／Cas library lentivirus 感染
后，用PCR扩增integrated gRNA，难度很大啊。谁做过这个screen，可以交流一下。万
分谢谢！ |
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C****n
发帖数: 79 | 42 我随机挑取了5个单clone， 提gDNA， PCR然后测序，这五个mutants之间的序列是不同
，但是对于每一个clone，只有一个测序结果，也就是说两个allel都突变成一样的序列
，这就很奇怪。 |
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v********a
发帖数: 646 | 43
The RNeasy Plus Mini Kit purifies up to 100 μg total RNA (>200 nt) from a
single extraction with efficient gDNA removal.
RNAs over 200nt are eligible for RNA-seq? |
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j****n
发帖数: 3370 | 44 用exonuclease切一切会不会有效果？
elute |
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f*****r
发帖数: 84 | 46 是一个library 的PLASMIDS, 所以跑胶会像smear，切一大块胶不知道产率会不会很低
呢。
exonuclease对plasmid 没影响么？
thanks! |
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f*****r
发帖数: 84 | 47 似乎有plasmid safe exonuclease 看来可以试一下。 Thanks! |
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f*****r
发帖数: 84 | 48 似乎有plasmid safe exonuclease 看来可以试一下。 Thanks! |
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f*****r
发帖数: 84 | 49 似乎有plasmid safe exonuclease 看来可以试一下。 Thanks! |
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m*********D
发帖数: 1727 | 50 考虑一下比较老的方法：Traditional Methods for CsCl Isolation
of Plasmid DNA by Ultracentrifugation |
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