D**R
发帖数: 371 | 1 最近做了一批RNA Extraciton，用NanoDrop测时碰到一个问题，大部分的RNA value都
在范围之内5-25 ng/ul，可是有两三个的samples值很高，超过200ng/ul，但是qPCR却
一点amplification也没有，那那个OD260 peak到底是什么东西呢？我们的是人的
sample，那些有bacterial contamination？怎么可以把它们去掉呢？多谢多谢 |
a***y
发帖数: 19743 | 2 RNA跑过胶吗
【在 D**R 的大作中提到】
: 最近做了一批RNA Extraciton，用NanoDrop测时碰到一个问题，大部分的RNA value都
: 在范围之内5-25 ng/ul，可是有两三个的samples值很高，超过200ng/ul，但是qPCR却
: 一点amplification也没有，那那个OD260 peak到底是什么东西呢？我们的是人的
: sample，那些有bacterial contamination？怎么可以把它们去掉呢？多谢多谢
|
D**R
发帖数: 371 | 3 你是说purify Rna之后的，没有，我们做完qPCR之后倒是跑过胶，跟别的正常的比没有
出来amplified的band，另外也差不多啊，你有什么建议呢？
【在 a***y 的大作中提到】
: RNA跑过胶吗
|
p**********t
发帖数: 2636 | 4 RNA 用qubit，nanodrop很不准确的，乱七八糟的contamination都会影响读数
你是说purify Rna之后的，没有，我们做完qPCR之后倒是跑过胶，跟别的正常的比没有
出来amplified的band，另外也差不多啊，你有什么建议呢？
【在 D**R 的大作中提到】
: 你是说purify Rna之后的，没有，我们做完qPCR之后倒是跑过胶，跟别的正常的比没有
: 出来amplified的band，另外也差不多啊，你有什么建议呢？
|
T**********t
发帖数: 1604 | 5 用bioanalyzer跑一下RNA看看有没有降解。另外楼上说了，Qubit测浓度比Nanodrop可
靠。不过如果RNA没有降解，纯度也够高的话，nanodrop应该够用的。 |
D**R
发帖数: 371 | 6 多谢楼上两位，我倒也不是追究NanoDrop的准确性，关键是有两个(2/30)samples给了
两个实在是非常漂亮的peak at OD260，但是qPCR啥也没有，那种低得都测不准的
samples反倒是出来amplification了，所以我很困惑那么高的band到底是什么东西，
bioanalyzer也ran一下，觉得可能有些gDNA和RNA降解了，但关键这一批samples来自同
一个site，ralative speaking，这么高的peak会是从哪里来的。
【在 T**********t 的大作中提到】
: 用bioanalyzer跑一下RNA看看有没有降解。另外楼上说了，Qubit测浓度比Nanodrop可
: 靠。不过如果RNA没有降解，纯度也够高的话，nanodrop应该够用的。
|
m****n
发帖数: 1066 | 7 DNA carry-over has reading at 260nm too. |
D**R
发帖数: 371 | 8 你有什么建议可以去掉这些DNA？I did DNase I digestion, but heat inactive不好
弄，而且容易 RNA Degradation.
【在 m****n 的大作中提到】
: DNA carry-over has reading at 260nm too.
|
T**********t
发帖数: 1604 | 9 DNase I不会degrade RNA。你有RNA degradation是因为你的sample有RNase污染。
DNase I处理之后跑胶纯化就不用管heat inactivation了，就是麻烦点。 |
x********e
发帖数: 35261 | 10 我用Invitrogen的Qubit Assay测RNA浓度
nanodrop测浓度是分不清DNA RNA的
【在 D**R 的大作中提到】
: 最近做了一批RNA Extraciton，用NanoDrop测时碰到一个问题，大部分的RNA value都
: 在范围之内5-25 ng/ul，可是有两三个的samples值很高，超过200ng/ul，但是qPCR却
: 一点amplification也没有，那那个OD260 peak到底是什么东西呢？我们的是人的
: sample，那些有bacterial contamination？怎么可以把它们去掉呢？多谢多谢
|
|
|
x********e
发帖数: 35261 | 11 Turbo DNase不用heat inactive
【在 D**R 的大作中提到】
: 你有什么建议可以去掉这些DNA？I did DNase I digestion, but heat inactive不好
: 弄，而且容易 RNA Degradation.
|
t**l
发帖数: 109 | 12 用megaclear KIT 可以提纯RNA。不过是KIT。恨KIT的达人自重啊 |
D**R
发帖数: 371 | 13 哦，这个我不知道，去看看，谢谢！
【在 x********e 的大作中提到】
: Turbo DNase不用heat inactive
|
D**R
发帖数: 371 | 14 为什么恨kit呢？
【在 t**l 的大作中提到】
: 用megaclear KIT 可以提纯RNA。不过是KIT。恨KIT的达人自重啊
|
X***n
发帖数: 366 | |
l**********1
发帖数: 5204 | 16 Pls do below Gel electrophoresis to
check for Genomic DNA contamination and RNA decay.
Optical density is used to assay the RNA yield and to check for
contamination by salt, solvent, protein, etc.
figure attached,
from
HTTP double dot //www.flychip.org.uk/protocols/gene_expression/rna_qc.pdf
【在 D**R 的大作中提到】
: 你是说purify Rna之后的，没有，我们做完qPCR之后倒是跑过胶，跟别的正常的比没有
: 出来amplified的band，另外也差不多啊，你有什么建议呢？
|
x********e
发帖数: 35261 | 17 问一下这个图里对应的ladder是多少的?
【在 l**********1 的大作中提到】
: Pls do below Gel electrophoresis to
: check for Genomic DNA contamination and RNA decay.
: Optical density is used to assay the RNA yield and to check for
: contamination by salt, solvent, protein, etc.
: figure attached,
: from
: HTTP double dot //www.flychip.org.uk/protocols/gene_expression/rna_qc.pdf
|
n********e
发帖数: 1630 | 18 你做qPCR 要不要把RNA 反转录到cDNA。 你用什么RT？ 可能RT效率很低，RNA浓度低了
就无法产生cDNA。 |
d********6
发帖数: 76 | 19 你的RNA extraction是怎么做的？有的时候如果phenol chloroform extraction没有做
好的话会有phenol在里边影响260的吸收，用纯的chloroform重新萃取几次就消失了。 |
c*****u
发帖数: 357 | 20
做QPCR实际上用不着bioanalyzer，简单一点跑个胶就够了，qPCR之前一定要跑胶( 差
点打成泡脚)。。。
目的是看你的sample是否有降解，是否有DNA污染，你的nanodrop 读数高可能是因为污
染了phenol
你要拿到像楼上那种电泳图再做，要看到清晰的mRNA，rRNA带，
【在 D**R 的大作中提到】
: 最近做了一批RNA Extraciton，用NanoDrop测时碰到一个问题，大部分的RNA value都
: 在范围之内5-25 ng/ul，可是有两三个的samples值很高，超过200ng/ul，但是qPCR却
: 一点amplification也没有，那那个OD260 peak到底是什么东西呢？我们的是人的
: sample，那些有bacterial contamination？怎么可以把它们去掉呢？多谢多谢
|
|
|
l**********1
发帖数: 5204 | 21 That fig used this one,
http://www.thermoscientificbio.com/nucleic-acid-electrophoresis
Btw, better is
Lambda Hind III
http://www.thermoscientificbio.com/nucleic-acid-electrophoresis
and 100 bp ladder up to 3kbp
http://www.thermoscientificbio.com/nucleic-acid-electrophoresis
load on the neighboor lanes seperately.
Just from our protocol.
【在 x********e 的大作中提到】
: 问一下这个图里对应的ladder是多少的?
|
D**R
发帖数: 371 | 22 我做的是qRT-PCR，那些测出来NanoDrop很低值的sample都有amplification出来，唯独
这几个看起来Peak很漂亮，OD260值很高的啥也没有，所以我很困惑那都是些什么东西
，maybe contaminated with bacterial RNA?
【在 n********e 的大作中提到】
: 你做qPCR 要不要把RNA 反转录到cDNA。 你用什么RT？ 可能RT效率很低，RNA浓度低了
: 就无法产生cDNA。
|
D**R
发帖数: 371 | 23 SurePrep RNA extraction kit from fisher, it's using column, no phenol
chloroform.
Actually I have really nice peak at 260, but no RT-PCR amplification.
【在 d********6 的大作中提到】
: 你的RNA extraction是怎么做的？有的时候如果phenol chloroform extraction没有做
: 好的话会有phenol在里边影响260的吸收，用纯的chloroform重新萃取几次就消失了。
|
D**R
发帖数: 371 | 24 Thanks for your figure, I'll look over it.
If it's contaminated by salt, what is the best way to clean it?
【在 l**********1 的大作中提到】
: Pls do below Gel electrophoresis to
: check for Genomic DNA contamination and RNA decay.
: Optical density is used to assay the RNA yield and to check for
: contamination by salt, solvent, protein, etc.
: figure attached,
: from
: HTTP double dot //www.flychip.org.uk/protocols/gene_expression/rna_qc.pdf
|
D**R
发帖数: 371 | 25 我应该没有用phenol.
【在 c*****u 的大作中提到】
:
: 做QPCR实际上用不着bioanalyzer，简单一点跑个胶就够了，qPCR之前一定要跑胶( 差
: 点打成泡脚)。。。
: 目的是看你的sample是否有降解，是否有DNA污染，你的nanodrop 读数高可能是因为污
: 染了phenol
: 你要拿到像楼上那种电泳图再做，要看到清晰的mRNA，rRNA带，
|
l**********1
发帖数: 5204 | 26 Below protocol pp9
Troubleshouting last item..
HTTP double dot//nippongene.com/pdf/manual_english/ISOGEN_2_111214.pdf
【在 D**R 的大作中提到】
: Thanks for your figure, I'll look over it.
: If it's contaminated by salt, what is the best way to clean it?
|
d********6
发帖数: 76 | 27 这种kit里边肯定都是有phenol的，不管是什么，这个东西抑制了你下一步的反应，而
且我感觉应该不是DNA。你可以直接用这个sample做PCR（不做RT），如果有DNA肯定会
有amplification的。我感觉这个PCR应该什么都没有，因为你的sample里边会有东西抑
制酶反应。
【在 D**R 的大作中提到】
: 我应该没有用phenol.
|
b****r
发帖数: 17995 | 28 看了半天没有一个人说
RNA 和DNA降解后，变成短链甚至核苷酸，260都是升高的，260：280甚至会高于2
如果你根据这个读书觉得质量“超级好”，那你就要小心了
简单的用DEPC H20 做胶和buffer，洗干净tank跑一下就知道了，大概1k多以下应该有
两条带，分别对应两条核糖体RNA，没有的话就可以歇了 |
