M*P
发帖数: 6456 | 1 那个就是扯蛋的，数据太少时代随便凑出来的结果。现在随便写个程序就知道根本就没
有几个基因有kozak序列。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8 |
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l***y
发帖数: 638 | 2 那你就随便写个程序run一下呗，能发篇不错的paper【 在 MHP (马后炮) 的大作中提
到: 】 |
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M*P
发帖数: 6456 | 4 http://www.ploscompbiol.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjour
Over 30 years ago Kozak suggested that a specific context (i.e. the
nucleotides before and after a codon) surrounding the initiating ATG codon
is required for its recognition by the pre-initiation complex; asserting
that this context should appear only in the vicinity of the initiating (
START) ATG codon of the ORF [10]. Nevertheless, several deviations from the
aforementioned scanning model have been reported based on small scale
e... 阅读全帖 |
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d****i
发帖数: 2346 | 5 印象中kozak序列不是翻译的必须序列，而是增强翻译的序列。没有kozak，仍然翻译，
但是水平不高，有了之后，更强。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 6 这是在讲笑话吧，或者压根没搞明白什么是kazak consensus |
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G***G
发帖数: 16778 | 8 after we get junctions.bed from tophat, can we map the junctions
to the exons and introns of transcripts?
Which tools allow us to do this?
thank you. |
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D*a
发帖数: 6830 | 9 你的老鼠是你自己做的还是买的？别人做成功过么？
有的老鼠就是不育，你重复了也不育吗？
现在是在做老鼠的过程中？还是做实验的过程中？
你最终要比较的是神马和神马？要lacz吗？还是只是不要exon 还是希望吧neo搞掉，还
是神马？ |
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s**2
发帖数: 1287 | 11 your former boss actually believes WiKi more than textbook? |
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d********n
发帖数: 15 | 13 You probably used polydT to reverse transcrible them into cDNA, then
performed fragmentation. this gives huge bias on 3/utr. not reliable for
expression level, even worse for analysis of exon junctions.But, it'll be
very good for pcpa (premature cleavage and poly adenylation) analysis. |
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i*********0
发帖数: 915 | 14 这个2bp deletion是啥意思？exon上的？ |
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e**r
发帖数: 1144 | 15 是的 ，一个比较短的exon上有2bp的deletion |
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j****x
发帖数: 1704 | 16 不是first exon？可能存在alternative splicing? |
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m******5
发帖数: 1383 | 17 同意！！
另外有一点，我觉得很多人都觉得上下两条带是alternative translation，其实很可
能是其它Sumo或者Ubiquitin或者磷酸化修饰导致的。alternative translation的可能
性我认为不大。
另一种更常见的情况是下面那条带其实是N-termianl truncation band.
我认为这几种情况都比alternative translation可能性大得多。
在楼主的case里，甚至有可能上下两条带都是Full-Length，只不过Flag antibody
affinity比HA antibody高很多，导致楼主误以为下面没有HA tag.
很多蛋白都有multiple in frame的ATG,通常后面的ATG是不会起作用的(除非有
alternative splicing或者复杂的RNA secondary structure.)
退一万步说，除了in frame的ATG,还有很多非in frame的ATG，设想一下，如果这些ATG
能起作用，细胞早就被junk protein淹没了(当然，非in frame产物如果不在最后的
... 阅读全帖 |
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h******u
发帖数: 602 | 18 一种干细胞血液疾病，预后很差。想测序看看能不能挖出有兴趣的致病基因突变。
请问大家都用那家做whole genome or Exon测序？
谢谢啦！ |
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w*****y
发帖数: 1201 | 19 我的理解是，SYBR是针对所有dsDNA，特异性要求比较高，我一般设计primer的时候，
会设计primer cross exon-intron splicing site，这样即使RNA有轻微的DNA污染，不
会对结果有影响，你的primer是如何设计的？ |
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g******r
发帖数: 139 | 20 Primer是从sigma买来的，都是选的cross exon-intron splicing site。但是假设是
primer不好，跟replicate well差异大有什么潜在联系吗？ |
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C*********h
发帖数: 83 | 21 是的。
错误的RNA很多时候没法stable, 会go nonsense decay
错误的蛋白很多时候无法正确折叠，被proteasome or autophagy清除。
, |
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l******3
发帖数: 25 | 23 做的是knockout-first的ko鼠，neo基因有独立的promoter
Mutant的序列大致是：FRT-lacZ-loxp1-neo-FRT-loxp2-exon-loxp3
现在拿到老鼠后是不是必须先和flp鼠交配去掉FRT之间那一大段序列？可是实验室之前
的人当作conditional KO鼠直接和cre的鼠交配了。我现在已经拿到ko小鼠开始做实验
了，突然发现前面那段序列没去掉，到底会不会有影响呢？可以继续作实验吗？还是必
须再重新折腾半年？
请大家帮忙看看，谢谢啦 |
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q******i
发帖数: 457 | 24 你的老鼠拿到手就是whole body Het，因为在exon前面插入了几千bp的片段，干扰了
target gene的表达，如果你直接breed het to het， 理论上可以得到 whole body KO
，当然你需要检测protein level以确认。如果你想要得到conditional KO, 就必须先
和flp的老鼠交配，去掉两个FRT之间的部分，得到的就是一个正常的flox老鼠，这时候
再和不同的cre交配就可以得到conditional KO。这种方法可以更快的得到whole body
KO，因为给你的就相当于Het了。 |
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s******e
发帖数: 796 | 25 check if each probe map to different exon per gene |
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c**o
发帖数: 56 | 26 我们group有病人，分析家族数据，找到致病的位点。已经作了好多个病人了。有个人
专门和病人联系，打电话，跟他们讲分析的结果。不过一般都是whole exon seq |
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s******s
发帖数: 13035 | 27 现实就是这样, 你不服也没用.
这玩意儿发展太快，前两年还都几百几百的测，现在的program都是成千上万的测了。
现在30x全基因组最低成本已经$1000了，更别说医院一般都是做exon。现在支持医
院里面NGS的funding/contract/trial多如牛毛, 你看看几家大的癌症中心吧。现在就
差最后一脚lobby让insurance公司进入了。 |
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i********f
发帖数: 206 | 28 Gene: BAG3 (基因的名称 http://www.genenames.org/)
Position: 121429523 (这个突变在染色体上的位置,报告里面应该有说明是哪个基因组
版本，现在比较常见的是GHRC37/hg19)
Isoform: NM_004281 (由于选择性剪切,一般每个基因可以表达出多个蛋白, 这个表示
是哪个transcript,比较好的应该加上版本号,例如 NM_004281.3)
Location: exon2 (这个表示突变发生在哪个exon上,不确定是以转录还是以翻译为开始)
Nucleotide: C341A>G (c.341A>G在DNA基础上的突变,在341的位置由A变成了G, 341是
以翻译点为开始，ATG中的A标号是1)
Amino Acid pY114 (在蛋白基础上的突变，这个应该没写全，应该是p.Y114C)
Zygosity: Het (这个表示只有一条突变了，另一条是正常的，杂合子)
Referenc/comments: Novel variant (全新的突变)
AA/EA: N/R N/R (这个可能是表示popula... 阅读全帖 |
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w*****r
发帖数: 2061 | 29 质粒要进核才能表达吧
有报道推荐的方法是设计gRNA是target intron-exon junction，这样质粒rescue就没
事。当然具体rescue效果还得要western验证 |
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x********e
发帖数: 35261 | 30 只是互补的话PCR的时候能成功吗，特别是flank两个exon的PCR？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 31 哎，我怎么觉得好像是反面宣传啊？ 搞得大家在看笑话似的。
从这个稿件看来那个研究还是有一定水平的，因为发现这种分子会把intron 保留着而
且能调节所在染色体位置的基因的转录，这些其实都是很有意义的突破，尤其是后者其
实很有意义。举个例子就是在测序中发现的很多很疾病相关的snp 都是位于intron ，
很少有位于exon的。但是那些snp一般都不会直接影响那个基因的splicing, 所以一直
有猜测这个是通过regulatory RNA 造成的。他们这个文章应该是找到了一种可能的机
制，估计也是他们下面的研究重点。在这个意义上他们的研究的确和很多疾病的机理有
关。但是被说成包治百病的暗物质听起来像是民科骗子似的。 |
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w***r
发帖数: 709 | 32 1. Nature. 2002 Jan 3;415(6867):45-53.
p53 mutant mice that display early ageing-associated phenotypes.
Tyner SD(1), Venkatachalam S, Choi J, Jones S, Ghebranious N, Igelmann H, Lu
X,
Soron G, Cooper B, Brayton C, Park SH, Thompson T, Karsenty G, Bradley A,
Donehower LA.
Author information:
(1)Cell and Molecular Biology Program, Baylor College of Medicine, Houston,
TX
77030, USA.
Comment in
Nature. 2002 Jan 3;415(6867):26-7.
The p53 tumour suppressor is activated by numerous stressors to ind... 阅读全帖 |
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l****y
发帖数: 486 | 33 Assume your knock-in here refers to mutating a site at the endogenous locus
(thus over expression-type approach, such as making transgenic mouse from
Rosa26 locus, will not be applied here).
Then the question is: you expect your mutation is a gain-of-function
mutation or loss-of-function mutation.
If your mutation is GOF mutation, it is easy, see Kras V12 KI strategy--
basically insert stopper element LSL before Kras V12 Exon. Note that the
allele LSL Kras V12 (before crossing with Cre) is a nul... 阅读全帖 |
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l*******t
发帖数: 1016 | 34 ensembl用习惯就方便了
variants
ensembl |
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m*********D
发帖数: 1727 | 35 其实，如果这个selection marker expression cassette不影响intron/exon splicing
,切不切出来都无所谓的。如果影响，一个essential gene就不可能了。我这次作的一
个基因就是cell growth essential的。 |
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b****r
发帖数: 17995 | 37 赞动手能力！能写个script挺好的。而且你也考虑到了common SNP和repeat的情况，还
能自检错误，很牛逼！
我的情况和你很相似，很多时候不是在exon所以那个library并不好用。我经常也是NGS
的validation，也有new assay的设计，new assay的话就必须尽全力避免common SNP了
纠正一下，刚才发现前面提过的ExonPrimer其实是提供避免SNP和repeat的功能的，所
以理论上还挺好用的，暂时可以说解决我的部分问题。但是就是还是不能测deap
intronic的，也不能随意指定位置，只能 一次产出整个基因的CDS或者cDNA
又搜到一个，这次可以随意指定coordinates了
https://github.com/gantzgraf/autoprimer3
primers |
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D*a
发帖数: 6830 | 38 不用sequence啊，你知道他从哪个exon/promoter哪个位置的哪个酶切位点连上的就行了
你把construction贴上来吧 |
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x********e
发帖数: 35261 | 39 enhancer可以在exon里，不一定非要在promoter附近, ChIP拉的是DNA不是RNA。的确有
些发表文章用的qPCR primer不是intron spanning，所以用之前一定要double check。 |
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x********e
发帖数: 35261 | 40 这不是在说ChIP么？genomic DNA分什么intron exon？如果是真信号，往两边几百bp设
计一系列引物就知道到底哪里是peak了。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 41 我瞎说两句没试过。
如果你知道具体的断裂点，就是只想看几千上万的candidate，而不是全看的话。
你把这个看成RNA就行了。把chromosome看成gene，把断裂点之间看成exon,
把跨断裂点的序列看成transcript, 自己做一个GTF file，然后用TOPHAT2, STAR
一类的试试。
reference |
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n******7
发帖数: 12463 | 42 1. 最好先根据siRNA的靶点估测一下这个isoform的序列构成
在某个coding exon上面最好
2. 如果大致确定是alternative splicing，而不是5'-/3'-的变化
可以根据全长isoform 的ORF设计引物做RT-PCR
如果这个short-form 表达量不是特别低的话
做一定数量的clone就可以抓住了
后续你怎么玩都可以了
3. 可以同时做一些bioinfo的分析
比如这个AS event很可能对应新的splicing junction
可以看一下已有的RNA-Seq data里面这个junction的表达情况
由此可以大致推断这个isoform是不是functional的
另外，也可以居然protein sequence的变化，看看是不是有些domain被打乱了
这样的话有可能跟全长蛋白功能相反的，这是比较有意思的一种情况
insensitive
isoform |
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c*********r
发帖数: 1312 | 43 受益颇多！
我也是最近分析自己的RNA-seq数据，想到TFBS这个问题。
我得到很多基因可能是被wnt/beta-catenin激活的。beta-catenin不是直接的TF，只是
co-factor，结合了TCF/LEF之后才激活下游基因表达。所以接下来很自然的发现，在随
机检查过的十多个基因第一个exon的上游，有很多predicted TCF binding site。我看
了上游3K的样子，没有海胆的TFBS预测软件，只好纯人工找。。。
然后我就在想那么control是什么？那些下调的或者其它细胞里没有被上调的基因？结
果我又手动检查了十个左右基因，我了个去，同样也有类似水平的TCF binding site。
。。后来老板提醒才想起来，TCF结合了起到抑制作用，后来beta-catenin结合上去了
才会有转录。所以真的就像你说的，binding不等于对基因有直接的调控啊！
这样看来，像我们海胆领域，每做一个TF的knockdown，overexpression都要做一大堆
in situ来看哪些基因真正受到调控，虽然费时费力，但是真的是最直接的证据。这点
上不得不佩服Er... 阅读全帖 |
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s*****i
发帖数: 315 | 44 我试了两次，没有做出来，完全用韩写的protocol做的，而且试过了分别转质粒和
oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
题。
质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？ |
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r********s
发帖数: 149 | 45 我也试了一次，没做出来。现在准备用他们的gata4来做positive control.
[在 samalli (小米) 的大作中提到：]
:我试了两次，没有做出来，完全用韩写的protocol做的，而且试过了分别转质粒和
:oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
:题。
:质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
:也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？
:天下熙熙，皆为利来；天下攘攘，皆为利往。 |
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p****s
发帖数: 3153 | 46 没有被改造，转进去的基因取代了原来失活的基因的作用；现在CRISPR疗法的一个适应
症DMD是通过改造基因的，通过CRISPR达到exon skipping的目的。 |
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发帖数: 1 | 47 发信人: samalli (小米), 信区: Biology
标 题: Re: 闊╂槬闆ㄧ殑NgAgo鏁堢巼鎬庝箞鏍凤紵鏈変汉璇曡繃涔堬紵
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jun 4 14:56:56 2016, 美东)
我试了两次，没有做出来，完全用韩写的protocol做的，而且试过了分别转质粒和
oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
题。
质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？ |
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发帖数: 1 | 48 发信人: raindallas (Never give up), 信区: Biology
标 题: Re: 闊╂槬闆ㄧ殑NgAgo鏁堢巼鎬庝箞鏍凤紵鏈変汉璇曡繃涔堬紵
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jun 4 20:32:20 2016, 美东)
我也试了一次，没做出来。现在准备用他们的gata4来做positive control.
[在 samalli (小米) 的大作中提到：]
:我试了两次，没有做出来，完全用韩写的protocol做的，而且试过了分别转质粒和
:oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
:题。
:质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
:也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？
:天下熙熙，皆为利来；天下攘攘，皆为利往。 |
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m****a
发帖数: 270 | 49 你的GFP/RFP放在Donor什么位置？如果要表达就得在exon里，这样岂不是和你loxp 位
点放intron 相矛盾 |
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发帖数: 1 | 50 GFP/RFP在两个同源臂的中间，自带promoter，不需要在exon上，为了移除荧光标签，
标签的两边连LOXP或者PiggyBac的TTAA-ITR。
左同源臂-ttaa-ITR-promoter-GFP-polyA-ITR-ttaa-右同源臂-promoter-BFP-polyA-
donor backbone
通过同源重组之后，左同源臂-ttaa-ITR-promoter-GFP-polyA-ITR-ttaa-右同源臂 会
进入基因组，如果donor存在randon integration，那么BFP也会表达，筛选BFP
negative/GFP positive/RFP positive的细胞即可。
然后过表达piggyBac transposase之后，筛选标签移除，变成左同源臂-ttaa-右同
源臂，
突变成功。
在设计左同源臂和右同源臂的时候，选择带有ttaa的位点分界，ttaa不要包括在同源臂
内。
说到这里，你是不是应该去补习一下基础理论知识。 |
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