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a**m
发帖数: 184 | 2 ucsc genome browser
give me the gene i ll look for it
baozi baozi |
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a********h
发帖数: 245 | 3 对于预测的准确性要小心。很多时候不是很准确，或者只能预测一种transcript. |
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G***G
发帖数: 16778 | 4 negative strand 上的snp的起始位置和终止位置
相当于正带上的什么位置？
negative strand上的exon的起始位置和终止位置
相当于正带上的什么位置？ |
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j****z
发帖数: 67 | 5 我有一个基因A-flox的line,我用mox2-cre的line,把它做了一个germline deletion,就
是 A+/-；mox2cre/+的老鼠 （通过检测cre确定genotype)，发现这个老鼠有我感兴趣
的phenotype.
现在我想继续研究基因A, 还是用这个A+/-， 但是要去掉mox2-cre.可是问题来了， 这
样的下一代老鼠，我怎么检测delete呢？在不知道A-flox具体序列的情况下，我怎么能
设计引物呢？
有没有什么公司能测genome上的小段序列？因为我大致知道是A基因的哪几个exon被
delete 了。
多谢多谢！ |
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b*********b
发帖数: 64 | 7 100%干净是不可能的，但是相对来说还是很干净的。我得用nested PCR才能扩出
genomic DNA来。如果你PCR的两条引物在不同的exons上的话，就更不用担心了。
啊？ |
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D*******r
发帖数: 162 | 8 real time没有变化，不能说明基因没被敲除。
也许有不完整的transcript,而你设计的引物pcr产物刚好完全包括在这个transcript里
，real time 没变化完全是有可能的。
建议1重新设计引物，一边引物在你敲掉的exon上
2 如果抗体available的话,做 wb 或 IHC
3 如果基因功能确定会影响某条信号通路的话，check该通路。 |
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a*******a
发帖数: 4233 | 9 永远用dnase处理一下
kit不贵的
还有一个小建议, 如果能直接染色或者wb就不要用realtime来验证了.
首先不是最终数据, 其次realtime不是决定性数据
如果要在mRNA水平检测ko, 最好的方法是在loxp两端远一点的地方设计引物PCR测序.
有时会碰到alternative splicing多切掉一个exon蛋白自动in frame的囧事... |
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d****u
发帖数: 275 | 10 现在DNA的徐的两端30bp都可信了？
我们实验室从前都是留100的overlap，读长800左右；
另外，这个exon多大？一组引物能覆盖完么 |
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a*******a
发帖数: 4233 | 11 做reporter construct的话， 一般包括第一个exon效果最好把 |
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h**2
发帖数: 2841 | 12 +1
不一定得包全，几百bp of exon 1即可
不过最好是去找几个ChIPseq data再来决定 |
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a*******a
发帖数: 4233 | 13 做reporter construct的话， 一般包括第一个exon效果最好把 |
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h**2
发帖数: 2841 | 14 +1
不一定得包全，几百bp of exon 1即可
不过最好是去找几个ChIPseq data再来决定 |
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x********e
发帖数: 35261 | 15 再补充一个。克隆genomic sequence时如果找不到合适的酶切位点（克隆序列越长，酶
切位点越受限）可以考虑gibson assembly。
Seq
exon |
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s******y
发帖数: 17729 | 16 我猜你没做过promoter克隆，没有别的意思，只是直觉
正经的promoter克隆，如果做功能的话，你说的几个方法一个都不对，或者说全是野路子
你随便拉一个做真正promoter的人出来，第一告诉你是用bac或者其他库，酶切。
虽然你也提到了bac但真的不是你那样用的，只有实在没有办法了，才走PCR的路子。
Seq
exon |
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l**********1
发帖数: 5204 | 17 Southern Bloting that is of course,
furthermore,
Western Blotting of that knocked in EXONs expressioned protein as 保险点的
Knockin check |
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j**W
发帖数: 89 | 18 You are right about a couple of things.I switch field and learned biology (
not including molecular biology) in English.And I did not make the targeting
vector. I took over the project starting from agouti mouse. Please bear
with me if I could not be clearer. I am sorry about the confusion on the
primer used for sequencing. We did sequencing with both P1 and P2. One came
back with no good sequence at all. From the sequencing result of the other,
it seems to me like P1. The sequencing result cove... 阅读全帖 |
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u*********1
发帖数: 2518 | 20 楼主，对于CNV，simply forget it
貌似只有DGV是比较靠谱的NIH-sponsor的数据库，但我从来不会用，也不知道怎么用。
你别说CNV-phenotype了，就连CNV本身就没啥靠谱的数据库。
或者说的更明白点，以目前的sequencing技术条件和后期数据处理，CNV
identification和validation几乎不可信。主要是sequencing reads太短，而CNV（包
括copy number variation，del，dup，inv，translocation等等）根本无法通过这么
短的reads被identify。。。其实别说CNV了，就连2bp的indel都很困难，因为比如
intron-exon boundary有时候会有一连串的TTTTTT，那么你要确定到底是多了两个T，
还是少了两个T，是很困难的。
1000 genome project目前有indel和large deletion的database。1000G最后present出
来的indel/deletion我是比较相信的，但问题是他们present出来的只是genome里... 阅读全帖 |
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m**********2
发帖数: 2646 | 21 You can use the Seqscape software (by applied biosystem I think). You can
put in all the exon information of this gene and import all the sanger
sequencing files at the same time. It will detect the SNPs right away (you
can set the threshhold, for example,call any mutation that is at 25% of the
WT in peak size).
After they made the SNP calls, you can click on each SNP to look at the peak
and determine whether it is homozygous or heterozygous.
The software cost about $4000~6000, but it has a 30-d... 阅读全帖 |
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r*****i
发帖数: 117 | 22 老板想做genome－wide exon sequencing。
问题是我们感兴趣的细胞数量很少，大约只有几百个，请问有这样的kit吗?
有经验的大侠能给个建议吗?
谢谢 |
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a******s
发帖数: 37 | 23 一个基因在对应其exon和intron的array probe都有很高的信号。intron的信号是来自
pre-mRNA呢，还是可能intron region还有什么特别的element？ |
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a********k
发帖数: 2273 | 24 不是测序太贵，是FDA的regulation太贵。
research实验室送个exon的bidirectional也就是$4-$5
到了诊断实验室给病人就到了$400-$500 |
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w****w
发帖数: 521 | 25 对于某些单基因疾病，在患者的exon上测到已知未知的nonsense/insertion/deletion
的mutation有很高比例，而正常人则很低。这种情况microarray显然不行。当然单基因
准确测序，排除pseudo基因的干扰，不是很容易就是了。 |
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a********k
发帖数: 2273 | 26 现实情况是在FDA的严格监管下，没有$200测不了一个exon。即使仪器+试剂0费用，大
部分断实验室做一次测序需要$100才保本。 |
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i*********0
发帖数: 915 | 27 intron几十个碱基，可能少了一点，我一般都是至少在exon留下50bps的距离，再插入
loxp位点。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 28 Before NGS 2.0 or 3.0 Illumina platform can read enough longer different
isoforms within Exome sequencing and systems biology aspect,
it is still elusive to answer the linkage between SNP2.0 or 3.0 alternative
splicing with
syndromic disease...
Pls check,
>Although previously described in TS, no CACNA1C mutations have been
reported for
>non-syndromic LQTS. With our functional studies confirming Cav1.2 gain-of-
function as the cellular basis for the CACNA1C mutation-positive patient’s
LQTS pheno... 阅读全帖 |
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m******g
发帖数: 467 | 29 今天去找导师汇报，本来觉得自己的内容太少，会被批评的，结果导师还鼓励了我，我
一定要加倍努力呀！感动ing。希望以后也能成为我导师那样的好导师！
Science 13.12.13
推荐：
1. Exonic Transcription Factor Binding Directs Codon Choice and Affects
Protein Evolution
概要：Long-Term Dynamics of Adaptation in Asexual Populations
Mean fitness seems to have no upper bound
Power law better than hyperbolic model
2. The Hidden Codes That Shape Protein Evolution
TF binding code
Human genome in 81 cell types
Constraining codes
~14% codons within 86.9% of genes are occupied by TFs
3. Cave... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 30 Before NGS 2.0 or 3.0 Illumina platform can read enough longer different
isoforms within Exome sequencing and systems biology aspect,
it is still elusive to answer the linkage between SNP2.0 or 3.0 alternative
splicing with
syndromic disease...
Pls check,
>Although previously described in TS, no CACNA1C mutations have been
reported for
>non-syndromic LQTS. With our functional studies confirming Cav1.2 gain-of-
function as the cellular basis for the CACNA1C mutation-positive patient’s
LQTS pheno... 阅读全帖 |
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m******g
发帖数: 467 | 31 今天去找导师汇报，本来觉得自己的内容太少，会被批评的，结果导师还鼓励了我，我
一定要加倍努力呀！感动ing。希望以后也能成为我导师那样的好导师！
Science 13.12.13
推荐：
1. Exonic Transcription Factor Binding Directs Codon Choice and Affects
Protein Evolution
概要：Long-Term Dynamics of Adaptation in Asexual Populations
Mean fitness seems to have no upper bound
Power law better than hyperbolic model
2. The Hidden Codes That Shape Protein Evolution
TF binding code
Human genome in 81 cell types
Constraining codes
~14% codons within 86.9% of genes are occupied by TFs
3. Cave... 阅读全帖 |
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l******u
发帖数: 936 | 32 http://investor.illumina.com/phoenix.zhtml?c=121127&p=irol-news
Illumina’s MiSeqDxTM Receives FDA Premarket Clearance with Two Cystic
Fibrosis Assays and Universal Kit for Open Use
Premarket Clearance is an Industry First for a Next-Generation Sequencing
System
SAN DIEGO--(BUSINESS WIRE)--Nov. 19, 2013-- Illumina, Inc. (NASDAQ:ILMN)
today announced that it received premarket clearance from the U.S. Food and
Drug Administration (FDA) for the MiSeqDx system, the first high-throughput
DNA sequencin... 阅读全帖 |
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d***s
发帖数: 1062 | 33 第一次参加这么大型的会议。好多临床的talk基本听不懂，但很喜欢这种氛围。
各种NGS非常热门，印象最深的是st. jude children's research hospital对几百多个
儿童白血病样本进行了whole genome，whole exon 和 RNA sequencing。有很多新发现
（不过不知道这个投入产出比率高不高）。 |
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T****i
发帖数: 15191 | 34 不是RNAseq，是exon capture。正要做RNAseq |
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l**********1
发帖数: 5204 | 35 Pls check,
i) Trapnell C et al., (2012).
Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments
with TopHat and Cufflinks.
Nat Protoc 7: 562–578.
ii) Li H et al., (2009).
The sequence alignment/Map format and SAMtools.
Bioinformatics 25: 2078–2079.
plus
Weikard R et al., (2013).
Identification of novel transcripts and noncoding RNAs in bovine skin by
deep next generation sequencing.
BMC Genomics. 14: 789. [Epub ahead of print]
>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24225384
c... 阅读全帖 |
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S*********e
发帖数: 127 | 36 what we have: mutant whole exome sequencing reads, three reference whole
genome sequence databases with SNPs.
What we want: sorting out point mutations in exons.
We are looking are a suitable aligner/program to sort out the high peak of
linkage loci.
Thanks, |
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l*******i
发帖数: 153 | 37 Bless宝宝！
请问楼主做的是exome-seq吧？宝宝父母也都测了吗？近亲有遗传史吗？如果没有，父
母均正常的话，很有可能应该就是de novo mutation了。de novo mutation在新生儿中
的发生率非常低，而且80%以上位于exon。
如果exome-seq没有发现de novo mutation,那说明mutation可能位于gene调控区，甚至
intron，上GWS或许可以发现某些异常，但是代价比较高昂。
我想说的是，像这样的基因缺陷病（姑且这么说吧，宝宝不一定是），最后即使找到了
defect的gene，对治疗可能也没你所期望的帮助。因此，我觉得，楼主现在首先要做的
是应该明确诊断，对症治疗是关键，首先把宝宝的病情控制住了，尽量减轻疾病带来的
伤害。
MCT |
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W*********n
发帖数: 775 | 38 谢谢！
您说的“ 一般情况下，看看TSS(transcription start site)前后20-50kb就差不多了
。转录起始位点后面的20-50k处，可能包括基因的所有intron 和Exon了，如果在这些
序列中发现转录因子结合位点，也可以认为它们参与了该基因的转录？
我最转录这块了解不多，现在对一个基因的转录调控比较感兴趣，所以想查查看看那些
转录因子调控它。希望专业人士给与指导。 |
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r***z
发帖数: 19 | 39 这个IRES-EGFP是加在最后一个外显子的终止密码子后面吧，last exon -ires-eGFP-
ployA. |
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r***z
发帖数: 19 | 40 如果我只是想加个 gfp 便于我观察这个基因是否表达，这样做行不行。 promoter ---
--- ATG+eGFP+first exon---- |
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d***s
发帖数: 1062 | 41 我们有个conditional KO小鼠，敲掉了部分exon。蛋白还能表达，但是truncated的。 |
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K**R
发帖数: 193 | 42 问大家个问题，我最近设计一对引物，上游设计到ATG起始位点上游大概100bp， 下游
在exon里，
结果还是有条带。 我想问问，一般情况下，反转cDNA后，大概有多少5’UTR被包含在
反转的成熟cDNA里？
非常感谢 |
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i*********0
发帖数: 915 | 43 谢谢啦！如果我看到一个gene intron表达是在control 和mutant里面比较一致，但是
检测exon的水平有差异的话，是不是表明，这个gene的转录后调控出了问题？ |
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W*********n
发帖数: 775 | 44 1） 细胞先转录出带内含子的mRNA, 请问提取RNA后，反转录成cDNA，这个cDNA里面
有没有未成熟的mRNA(intron 没有来得及剪贴掉)反转录出来的？也就是说，反转录DNA
（cDNA）里面，可能含有intron吗？
2） 做一个同源基因的克隆，该基因有三个外显子，在第一个被初步annotated的外
显子上游，可以找到另外2个位点编码Met，可以使蛋白往N末端延伸10个或20个aa。我
假定它是从往上延伸20aa的位点开始翻译，然后设计引物，在cDNA中扩增该基因。结果
显示扩增出来的序列就是3个外显子序列和那上游20aa对应的序列，没有任何内含子。
这是否说明该基因就是从往上游延伸20aa的地方起始翻译的呢？ |
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W*********n
发帖数: 775 | 47 谢谢。那么若已知基因组序列，在知道翻译起始位点大致位置，并有两三个Met时，怎
样准确确定从哪一个Met开始翻译？ |
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W*********n
发帖数: 775 | 48 您可以回答，也可以因为简单不屑于回答。居高临下的打击别人，就没有意思了吧。 |
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i***l
发帖数: 1656 | 49 不能预测
正常时候也有两个位置上都有Met 相差23AA，两个蛋白都被正常翻译的情况。 |
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