L**o
发帖数: 15 | 1 做了一个常规的chip-qPCR想检测一个转录因子有没有在某个基因的启动子区有富集，
先用特异性的抗体做CHIP，然后做qPCR，结果和mock相比，在启动子区和几个CNS区都
没有明显富集。当时错拿了一管该基因的普通qPCR引物，在该基因外显子上，结果在这
个区域像是有富集，相比mock，转化成input%大概是3%比0.1%
这怎么解释呢？
多谢指教。 |
l********e
发帖数: 415 | 2 说明你的qPCR引物设计的相当之烂，因为正常人都是设计flanking intron，在DNA模板
上是拉不出东西来的。 |
L**o
发帖数: 15 | 3 这个是很多文章报道过的，我也就没仔细看
【在 l********e 的大作中提到】
: 说明你的qPCR引物设计的相当之烂，因为正常人都是设计flanking intron，在DNA模板
: 上是拉不出东西来的。
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L**o
发帖数: 15 | 4 这个是很多文章报道过的，我也就没仔细看
【在 l********e 的大作中提到】
: 说明你的qPCR引物设计的相当之烂，因为正常人都是设计flanking intron，在DNA模板
: 上是拉不出东西来的。
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x********e
发帖数: 35261 | 5 enhancer可以在exon里，不一定非要在promoter附近, ChIP拉的是DNA不是RNA。的确有
些发表文章用的qPCR primer不是intron spanning，所以用之前一定要double check。
【在 L**o 的大作中提到】
: 做了一个常规的chip-qPCR想检测一个转录因子有没有在某个基因的启动子区有富集，
: 先用特异性的抗体做CHIP，然后做qPCR，结果和mock相比，在启动子区和几个CNS区都
: 没有明显富集。当时错拿了一管该基因的普通qPCR引物，在该基因外显子上，结果在这
: 个区域像是有富集，相比mock，转化成input%大概是3%比0.1%
: 这怎么解释呢？
: 多谢指教。
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T*****e
发帖数: 247 | 6 我知道enhancer可以在exon里，特别是有的exon对于有的transcript并不是真的exon。
有没有系统讲这个的文章？我只是有这个印象，这对找enhancer其实是非常关键的一件
事。 |
l********e
发帖数: 415 | 7 与其相信enhancer在exon, 还不如相信楼主sonication做的不彻底，intronic
enhancer把exon sequence带出来了。
【在 x********e 的大作中提到】
: enhancer可以在exon里，不一定非要在promoter附近, ChIP拉的是DNA不是RNA。的确有
: 些发表文章用的qPCR primer不是intron spanning，所以用之前一定要double check。
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g*********3
发帖数: 177 | 8 LZ的实验结果不一定可靠。
只说两个数字0.1% Vs.3%.
可以参考Abcam及其他抗体的说明书，一般你的input%能达到0.3%就已经非常牛叉了。(
我这里说的是histone的)，对于TF，我基本没有见过有人敢报出input% (因为实在太低
了，不过也不要紧，得和mock比较)。
你的mock都有0.1%之高，说明你的mock IP有太多input DNA，除了楼上说的sonication
不完全，还有wash是不是extensive的等等其他因素。（可以google好好看看chip
protocol）。
你的IP有3%，这个简直是让我震惊。。。。同样存在我上一段解释的问题，另外你是不
是overcrosslink了等其他因素
你的这些数字如果是给真正做ChIP的人review，会有涉嫌造假的嫌疑。还是先好好优化
下chip条件（除了有mock，还得有IgG，negative primer等等其他一起比较），chip-
qpcr不是一个容易的活儿，论坛上以前讨论过的。 |
x********e
发帖数: 35261 | 9 这不是在说ChIP么？genomic DNA分什么intron exon？如果是真信号，往两边几百bp设
计一系列引物就知道到底哪里是peak了。
【在 l********e 的大作中提到】
: 与其相信enhancer在exon, 还不如相信楼主sonication做的不彻底，intronic
: enhancer把exon sequence带出来了。
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v********a
发帖数: 646 | 10 路过。。。
这个不是有kit么？
想问问大家，sonication到底怎样操作，才是规范的？
我最近在做RBP,用1.5ml ep管（多少体积的液体比较合适），超声5sec，然后冰上
20sec,重复3次。这样合适么？如何判断超声是否彻底，完全释放出细胞内容物？
此外，所有的protocol都提示不要出现泡沫，但是我发现无法不产生泡沫。
求指教，谢谢 |
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k*****n
发帖数: 323 | 11 1.5ml的管子700ul-1ml，tip在不接触管壁的情况下尽量往下插，shearing的够不够主
要看片段了150-1000 for seq，200-1500 for pcr |
d***s
发帖数: 1062 | 12
找台bioruptor。非常简单
【在 v********a 的大作中提到】
: 路过。。。
: 这个不是有kit么？
: 想问问大家，sonication到底怎样操作，才是规范的？
: 我最近在做RBP,用1.5ml ep管（多少体积的液体比较合适），超声5sec，然后冰上
: 20sec,重复3次。这样合适么？如何判断超声是否彻底，完全释放出细胞内容物？
: 此外，所有的protocol都提示不要出现泡沫，但是我发现无法不产生泡沫。
: 求指教，谢谢
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l********e
发帖数: 415 | 13 跑胶或者bioanalyzer看size,超声的目的是打碎DNA
【在 v********a 的大作中提到】
: 路过。。。
: 这个不是有kit么？
: 想问问大家，sonication到底怎样操作，才是规范的？
: 我最近在做RBP,用1.5ml ep管（多少体积的液体比较合适），超声5sec，然后冰上
: 20sec,重复3次。这样合适么？如何判断超声是否彻底，完全释放出细胞内容物？
: 此外，所有的protocol都提示不要出现泡沫，但是我发现无法不产生泡沫。
: 求指教，谢谢
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z*t
发帖数: 863 | 14 mock 0.1%的确很高
不过比3% IP高的paper发出来的有一大把...
最后好多人干脆relative enrichment了事，嘿嘿
。(
sonication
【在 g*********3 的大作中提到】
: LZ的实验结果不一定可靠。
: 只说两个数字0.1% Vs.3%.
: 可以参考Abcam及其他抗体的说明书，一般你的input%能达到0.3%就已经非常牛叉了。(
: 我这里说的是histone的)，对于TF，我基本没有见过有人敢报出input% (因为实在太低
: 了，不过也不要紧，得和mock比较)。
: 你的mock都有0.1%之高，说明你的mock IP有太多input DNA，除了楼上说的sonication
: 不完全，还有wash是不是extensive的等等其他因素。（可以google好好看看chip
: protocol）。
: 你的IP有3%，这个简直是让我震惊。。。。同样存在我上一段解释的问题，另外你是不
: 是overcrosslink了等其他因素
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a******r
发帖数: 786 | 15 我做的histone一般都在0.1%- 2%之间
negative 好像必须小于0.01%要不然算渣
【在 z*t 的大作中提到】
: mock 0.1%的确很高
: 不过比3% IP高的paper发出来的有一大把...
: 最后好多人干脆relative enrichment了事，嘿嘿
:
: 。(
: sonication
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g*********3
发帖数: 177 | 16 恩 参考ambiencr的回复，和我的数字基本一致。
histone这种和DNA绕在一起的蛋白，才有2%。 那种动不动TF就有2%（见过一个日本哥
们report 10%的），数据要么就是故意造假，要么就是不怎么clean。
能够诚实摆出来relative enrichment还算好的。不过TF 2%的时候（我本人做过各种优
化，基本对于TF很难达到这么多，何况有谁真正count过TF在某个时刻在某个基因上结
合的个数），这种enrichment又有多少可信度呢。
【在 z*t 的大作中提到】
: mock 0.1%的确很高
: 不过比3% IP高的paper发出来的有一大把...
: 最后好多人干脆relative enrichment了事，嘿嘿
:
: 。(
: sonication
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g*********3
发帖数: 177 | 17 恩 参考ambiencr的回复，和我的数字基本一致。
histone这种和DNA绕在一起的蛋白，才有2%。 那种动不动TF就有2%（见过一个日本哥
们report 10%的），数据要么就是故意造假，要么就是不怎么clean。
能够诚实摆出来relative enrichment还算好的。不过TF 2%的时候（我本人做过各种优
化，基本对于TF很难达到这么多，何况有谁真正count过TF在某个时刻在某个基因上结
合的个数），这种enrichment又有多少可信度呢。
【在 z*t 的大作中提到】
: mock 0.1%的确很高
: 不过比3% IP高的paper发出来的有一大把...
: 最后好多人干脆relative enrichment了事，嘿嘿
:
: 。(
: sonication
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D***a
发帖数: 516 | 18 问一下ChIP－qPCR三次重复做统计的问题，文章里面的error bar都很小，我的数据就
做不出来这么小的error bar。跟input比，比如第一次0.8％ vs 0.2％，第二次0.4％
vs 0.1％，趋势是一样子的，但error bar算出来很大。真的有可能每次都能做到相似
的input比例？ |
D***a
发帖数: 516 | 19 re
％
【在 D***a 的大作中提到】
: 问一下ChIP－qPCR三次重复做统计的问题，文章里面的error bar都很小，我的数据就
: 做不出来这么小的error bar。跟input比，比如第一次0.8％ vs 0.2％，第二次0.4％
: vs 0.1％，趋势是一样子的，但error bar算出来很大。真的有可能每次都能做到相似
: 的input比例？
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A***u
发帖数: 3714 | 20
【在 L**o 的大作中提到】
: 做了一个常规的chip-qPCR想检测一个转录因子有没有在某个基因的启动子区有富集，
: 先用特异性的抗体做CHIP，然后做qPCR，结果和mock相比，在启动子区和几个CNS区都
: 没有明显富集。当时错拿了一管该基因的普通qPCR引物，在该基因外显子上，结果在这
: 个区域像是有富集，相比mock，转化成input%大概是3%比0.1%
: 这怎么解释呢？
: 多谢指教。
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