b****r
发帖数: 17995 | 1 如果能解决俺这个问题，五黄包答谢，困扰已久。不同方法越多越好，包子很多
我们做各种突变检查多态分析，经常要把目的位置（经常是1bp，最多几十bp）用PCR扩
增出来然后测序，但是目前总是只能用笨办法，先用UCSC标记好附近的SNP和repeat区
域，然后把周围几百bp拿出来扔到Primer3去设计primer，效率太低了，特别是有时候
要测几十个突变，能搞几天
我总觉得这种工作做遗传的人会经常要做，但是似乎搜不到这样的软件或者数据库提供
自动的引物设计。我觉得这样的软件相关引用率应该会非常高啊，而且不应该很难实现 |
g*********3
发帖数: 177 | 2 这种软件写了发不出去吧。
你这个问题shell script就应该能解决（repeat的primer可能不太好弄）：
把human genome fasta下载下来，然后准备好你的所有SNP的bed file，用
fastafrombed（类似这样的工具太多了）找出序列，直接在SNP左右加减比如300bp，随
机从两端选取20bp，countGC content。这样就足够了。
找个周围做bioinfo的，几分钟能帮你解决。 |
i*e
发帖数: 352 | 3 有软件multiple primer design的，但是多少不如意
我最后是自己写了一个小脚本
马马虎虎可以应付
发文章就算了，没多少含金量
【在 b****r 的大作中提到】
: 如果能解决俺这个问题，五黄包答谢，困扰已久。不同方法越多越好，包子很多
: 我们做各种突变检查多态分析，经常要把目的位置（经常是1bp，最多几十bp）用PCR扩
: 增出来然后测序，但是目前总是只能用笨办法，先用UCSC标记好附近的SNP和repeat区
: 域，然后把周围几百bp拿出来扔到Primer3去设计primer，效率太低了，特别是有时候
: 要测几十个突变，能搞几天
: 我总觉得这种工作做遗传的人会经常要做，但是似乎搜不到这样的软件或者数据库提供
: 自动的引物设计。我觉得这样的软件相关引用率应该会非常高啊，而且不应该很难实现
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b****r
发帖数: 17995 | 4 这种效率也不高啊。一般就是每一两天出来两三个需要设计引物的位点要设计引物
而且人基因组太复杂，很容易出现非特异性扩增。你看primer3 考虑了多少因素，随机
选20bp那样效果肯定要打很多折扣，如果10个里面有一个因此要重复的话，那一个就要
多耽误好几天，不光说成本，光是耽误的时间对于临床检测可以说很致命，还不如现在
这样多花几十分钟手工设计算了
我觉得其实就是写个script，从UCSC网页帮你输入需要的位点，再扒下来标记好的SNP
，repeat，homopolymer等要避免的地方，然后帮你扔到primer3里去，再把primer3设
计的引物扒下来，这样应该是最理想的。我觉得每个临床遗传实验室都会需要这样的软
件的，别说引用文章里，哪怕要license fee都非常值得，起码我的lab会愿意掏钱买
【在 g*********3 的大作中提到】
: 这种软件写了发不出去吧。
: 你这个问题shell script就应该能解决（repeat的primer可能不太好弄）：
: 把human genome fasta下载下来，然后准备好你的所有SNP的bed file，用
: fastafrombed（类似这样的工具太多了）找出序列，直接在SNP左右加减比如300bp，随
: 机从两端选取20bp，countGC content。这样就足够了。
: 找个周围做bioinfo的，几分钟能帮你解决。
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i*e
发帖数: 352 | 5 另外一个方法，就是Life Technologies的在线引物设计和直接order，估计很多人会喜欢
https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/sequencing/sanger-
sequencing/pre-designed-primers-pcr-sanger-sequencing.html
SNP
【在 b****r 的大作中提到】
: 这种效率也不高啊。一般就是每一两天出来两三个需要设计引物的位点要设计引物
: 而且人基因组太复杂，很容易出现非特异性扩增。你看primer3 考虑了多少因素，随机
: 选20bp那样效果肯定要打很多折扣，如果10个里面有一个因此要重复的话，那一个就要
: 多耽误好几天，不光说成本，光是耽误的时间对于临床检测可以说很致命，还不如现在
: 这样多花几十分钟手工设计算了
: 我觉得其实就是写个script，从UCSC网页帮你输入需要的位点，再扒下来标记好的SNP
: ，repeat，homopolymer等要避免的地方，然后帮你扔到primer3里去，再把primer3设
: 计的引物扒下来，这样应该是最理想的。我觉得每个临床遗传实验室都会需要这样的软
: 件的，别说引用文章里，哪怕要license fee都非常值得，起码我的lab会愿意掏钱买
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b****r
发帖数: 17995 | 6 谢谢，这个还不错，不过似乎没有躲避SNP和repeat的功能啊。先请收俩包子
我刚才倒是自己搜到一个，在UCSC里其实已经整合好了，叫做ExonPrimer，纠正一下，
确实有躲开SNP和repeat的功能，有点可惜的是没有batch design的功能
喜欢
【在 i*e 的大作中提到】
: 另外一个方法，就是Life Technologies的在线引物设计和直接order，估计很多人会喜欢
: https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/sequencing/sanger-
: sequencing/pre-designed-primers-pcr-sanger-sequencing.html
:
: SNP
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i*e
发帖数: 352 | 7 如果你关注的是一匹基因，而且也只在乎exons，那么有一套引物测试过，之后就不用
每次设计了
看上去BatchPD是有在设计引物做SNP QC的，你也可以看看
文章 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3346021/pdf/97320630008365.pdf
设计好的引物 http://www.fos.auckland.ac.nz/~dlai008/
【在 b****r 的大作中提到】
: 谢谢，这个还不错，不过似乎没有躲避SNP和repeat的功能啊。先请收俩包子
: 我刚才倒是自己搜到一个，在UCSC里其实已经整合好了，叫做ExonPrimer，纠正一下，
: 确实有躲开SNP和repeat的功能，有点可惜的是没有batch design的功能
:
: 喜欢
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b****r
发帖数: 17995 | 8 我主要关心的其实就是能不能躲开SNP，最好也能躲开homopolymer，repeats，这些都
是对Sanger结果很致命的。在一两个标本上的一两次测试不能解决这个问题啊
If there happens to be a SNP located at the 3’ end of the primer, the
primer will very likely to fail to amplify. For my purpose that is pretty
much lethal, as if I am trying to see if a heterozygous mutation is in a
patient’s DNA, but your primer happen to locate in one of the patient’s
SNP and mismatch, the PCR will probably only amplify the wildtype allele,
not the mutant allele. And SNPs are so common in the population, this kind
of events won’t be rare at all, and I may make a wrong diagnosis if based
on this result.
【在 i*e 的大作中提到】
: 如果你关注的是一匹基因，而且也只在乎exons，那么有一套引物测试过，之后就不用
: 每次设计了
: 看上去BatchPD是有在设计引物做SNP QC的，你也可以看看
: 文章 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3346021/pdf/97320630008365.pdf
: 设计好的引物 http://www.fos.auckland.ac.nz/~dlai008/
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i*e
发帖数: 352 | 9 没有啥能100%万无一失的，BatchPD那个估计common SNPs都已经考虑了，rare的不清楚
，不过rare的话碰到的概率也小很多。此外individual个体还可能有未知的rare
variants，这个就更控制不了了。
看你之前所说，感觉是用来做validation不是detection的，所以万一有那么几个
readout不一致，换对引物或者用其他方法再验证一下。
我有可能记错，不错homopolymer和repeats在exons没有在3‘或者5’端频繁，有碰到
再分别单个手工设计引物好了。
我自己那个script，主要针对自己的实验目的，是WGS的variant validation，主要是
SNVs和小的Indels，也不单单是exonic，所以大多数面向exons的predesigned primers
就无用了，再说SNPs也没有被先排除。
设计引物的时候，input是VCF，已知的common和rare SNPs （dbSNP142）都有先
flagged，然后primer3的结果只取第一个output，之后in silico PCR再过一次，没过
的重新滚回去换个amplicon 长度设计另外一对。不过homopolymer和repeats我就不在
意了。
非常粗旷简陋的script，不过大体思路就是上面说的那样。
【在 b****r 的大作中提到】
: 我主要关心的其实就是能不能躲开SNP，最好也能躲开homopolymer，repeats，这些都
: 是对Sanger结果很致命的。在一两个标本上的一两次测试不能解决这个问题啊
: If there happens to be a SNP located at the 3’ end of the primer, the
: primer will very likely to fail to amplify. For my purpose that is pretty
: much lethal, as if I am trying to see if a heterozygous mutation is in a
: patient’s DNA, but your primer happen to locate in one of the patient’s
: SNP and mismatch, the PCR will probably only amplify the wildtype allele,
: not the mutant allele. And SNPs are so common in the population, this kind
: of events won’t be rare at all, and I may make a wrong diagnosis if based
: on this result.
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b****r
发帖数: 17995 | 10 赞动手能力！能写个script挺好的。而且你也考虑到了common SNP和repeat的情况，还
能自检错误，很牛逼！
我的情况和你很相似，很多时候不是在exon所以那个library并不好用。我经常也是NGS
的validation，也有new assay的设计，new assay的话就必须尽全力避免common SNP了
纠正一下，刚才发现前面提过的ExonPrimer其实是提供避免SNP和repeat的功能的，所
以理论上还挺好用的，暂时可以说解决我的部分问题。但是就是还是不能测deap
intronic的，也不能随意指定位置，只能 一次产出整个基因的CDS或者cDNA
又搜到一个，这次可以随意指定coordinates了
https://github.com/gantzgraf/autoprimer3
primers
【在 i*e 的大作中提到】
: 没有啥能100%万无一失的，BatchPD那个估计common SNPs都已经考虑了，rare的不清楚
: ，不过rare的话碰到的概率也小很多。此外individual个体还可能有未知的rare
: variants，这个就更控制不了了。
: 看你之前所说，感觉是用来做validation不是detection的，所以万一有那么几个
: readout不一致，换对引物或者用其他方法再验证一下。
: 我有可能记错，不错homopolymer和repeats在exons没有在3‘或者5’端频繁，有碰到
: 再分别单个手工设计引物好了。
: 我自己那个script，主要针对自己的实验目的，是WGS的variant validation，主要是
: SNVs和小的Indels，也不单单是exonic，所以大多数面向exons的predesigned primers
: 就无用了，再说SNPs也没有被先排除。
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D*********e
发帖数: 11 | 11 我记得Sequenom有专门的软件批量设计引物，不过是有限制的，PCR产物的大小只有100
多bp
【在 b****r 的大作中提到】
: 如果能解决俺这个问题，五黄包答谢，困扰已久。不同方法越多越好，包子很多
: 我们做各种突变检查多态分析，经常要把目的位置（经常是1bp，最多几十bp）用PCR扩
: 增出来然后测序，但是目前总是只能用笨办法，先用UCSC标记好附近的SNP和repeat区
: 域，然后把周围几百bp拿出来扔到Primer3去设计primer，效率太低了，特别是有时候
: 要测几十个突变，能搞几天
: 我总觉得这种工作做遗传的人会经常要做，但是似乎搜不到这样的软件或者数据库提供
: 自动的引物设计。我觉得这样的软件相关引用率应该会非常高啊，而且不应该很难实现
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b****r
发帖数: 17995 | 12 sequenom那是给他自己的assay设计引物的吧？
100
【在 D*********e 的大作中提到】
: 我记得Sequenom有专门的软件批量设计引物，不过是有限制的，PCR产物的大小只有100
: 多bp
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