D***a
发帖数: 516 | 1 用293T细胞，转lentivirus病毒载体和gagpal+vsvg,产生的病毒是不是有一部分又感染
回到293T了？那这个会增加病毒产率（比如说感染回去，vector又可以被复制，产生新
的病毒）还是降低病毒产率（病毒被消耗掉了）？
我的一个shRNA病毒产量总是很低（一个是共转染之后293T荧光少（载体含GFP），另一
个是病毒infect target cell后筛选，得到的克隆少得多），跟control和另外一个
gene family isoform相比。我做了不加gagpal和vsvg,把载体单独转到293T里面，从
GFP荧光看plasmid质量没问题，跟control是一样的。查到有文章提到这个蛋白可以帮
助病毒entry，是不是就是病毒低的原因呢？
谢谢大家。 |
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f*******g
发帖数: 35 | 2 最近在养293T cells, 转染或者未转染的293T细胞放在FASC buffer (PBS+5% FBS）中
，然后在室温或者ice上放置两到三个小时，用7-AAD染色，发现60%的细胞都是 7-AAD+ （做 FACS的时候离 trypsinization差不多5-6小时吧）。刚刚trypsinized的细胞，然后立即作FACS， 7-AAD+的细胞比例很低，只有1-2%左右吧。
请问这种情况正常么？
我看到有的paper上， 293T细胞在室温或者冰上放置16个小时，然后用相应的抗体染色
，然后FACS 分析。 这种情况难道所有的293T 细胞不会全部死掉么？ 如果细胞都死了
，应该都会被染色吧 ？
高手来分析一下吧？谢谢！ |
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s*****3
发帖数: 41 | 3 最近在用293T表达外源蛋白,然后用抗体检测蛋白表达水平。 不知道为什么细胞的
viability非常低，我用7-AAD 染色，viability只有50%。请教实验室前辈这可能是什
么原因导致的呢？
我通常 seed 293T cells the day before transfection at the density of 0.5
million/well (6-well plate).
In the afternoon next day transfect 293T cells with plasmids using FugeneHD.
About 36 hours later, detach cells with trypsin and then stain with the
primary antibody on ice for 30 minutes and then incubate with PE-conjugated
secondary antibodies on ice for 30 minutes. FACS analysis is done
immediate... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 4 The critical things is the plasmid without a SV40 replica site will
not be replicated in 293T cell and therefore will be "diluted"
after each cell passage.
Usually the thumb of rules are keeping the transfected cell of at
least 10% of the total cells.
293T cells are usually very easy to transfect so we can assume 90%
are transfected in the begining. However if the transfection of your protein make the cells grow slower, the untransfected cell will out-grow the transfected ones in a few days. As |
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C*****h
发帖数: 926 | 5 1. Seed 1.5x106 293T cells per 10 cm plate in 10 ml growth media (
DMEM + 10% FBS). Usually, one T-175 flask of 293T cells at 90-95% confluency
is split to 12 plates (10-cm).
2. Incubate cells for 24 hours (37 °C, 5% CO2), or until the cells reach 40
-50% confluency (no more than 70%).
3. One hour before transfection, replace old growth media with 9 ml fresh
growth media (DMEM + 10% FBS).
a. Prepare plasmid mixture at 23 °C:
430 ul H2O
20 ul plasmid (1 ug/ul)
50 ul CaCl2 (2.5... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 6 If your plasmid has SV40 replicate sites and if the expression doesn't kill
the 293T cells, then I think you can grow them for a week or more. |
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s******y
发帖数: 28562 | 7 Then you can only keep them for up to the double number of cells
In most case it only take one day for the 293T cell to grow to double number.
In your particular case you will have to judge by yourself |
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o**4
发帖数: 35028 | 8 Oh,I see
It's very good to know this.
Thanks again
protein make the cells grow slower, the untransfected cell will out-grow
the transfected ones in a few days. Assuming the 293T cells replicate every
24 hours, then in three days, the 10% untransfected cells will become 8
times of their original number and therefore will reach almost 80% of the
total cell population. |
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R*****w
发帖数: 447 | 9 学习了，
请问怎么知道plasmid 是否有SV40 replica site? pcDNA3.1 有SV40 replica site吗？
protein make the cells grow slower, the untransfected cell will out-grow
the transfected ones in a few days. Assuming the 293T cells replicate every
24 hours, then in three days, the 10% untransfected cells will become 8
times of their original number and therefore will reach almost 80% of the
total cell population. |
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s******y
发帖数: 28562 | 10 看一下vector map或者说明书，上面有的。
要知道这个sv40怎么来的不妨自己google 一下
并不是每一种细胞都有这个功能的，293T 细胞是因为被某种病毒感染了所以才有
这种功能
我刚才给他算的那个答案是针对他的具体情况算的。对于别的情况要修改一下
算法.
不过一般来讲是不应该超过3天。
吗？
every |
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R*****w
发帖数: 447 | 11 Thank you very much, sunnyday!
I figured it out and found that pcDNA3.1 does have sv40 origin.
The following is some information from Wiki, in case someone else is
interested in this:
HEK 293 cells were generated in early 70s by transformation of cultures of
normal human embryonic kidney cells with sheared adenovirus 5 DNA in Alex
Van der Eb's laboratory in Leiden, Holland.
An important variant of HEK293 cell line is the 293T cell line that contains
, in addition, the SV40 Large T-antigen, that |
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s*****t
发帖数: 107 | 12 最近一直在为293T细胞的转染发愁，如果那位大虾有磷酸钙的配方和protocol，请发给
我，非常感谢，
10个包子的酬谢！ |
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S*******m
发帖数: 34 | 14 You can save some time by adding plasmid mixture (immediately after
preparation) to trypsinized and resuspended 293T cells. Worked pretty
well for me.
To save some money, you can also prepare a batch of HBS with different
pH and test which one works best for you.
confluency
reach 40
fresh |
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p****y
发帖数: 95 | 15 PEI Transfection
Transfection:
1. Split 293T cells one day before transfection in DMEM/10% FBS medium:
a. 6 well dish: 0.5x106 cells
b. 10cm dish: 4.0x106 cells
c. 15cm dish: 9.0x106 cells
2. Prior to transfection bring all reagents to room temperature.
3. In a sterile tube dilute total plasmid DNA (ug) in serum-free DMEM w/o
phenol red (volume of media is 10% of final volume in culture vessel). Use
transgene: viral packaging (psPAX2):viral envelope (pMD2G) constructs at 4:2
a.... 阅读全帖 |
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o**d
发帖数: 3080 | 16 换别的293T来试试，貌似你的这一株细胞有问题。 |
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S*****s
发帖数: 287 | 17 你是不是检查一下你的 FACS Buffer？ 比如PBS 的 pH 值，是 1X 还是 10X PBS，FBS
有没有过期，或者 7-AAD 买了多久了？我也用 293T 做 Flow，样品分解成单细胞后
要花六到七个小时染色，然后每个样品里加 7-AAD 做对照。我的样品里 7-AAD
positive 的细胞都不多。我在 Negative 的细胞里 gate 一部分出来作为 P1，P1 一
般都在 70% 以上，另外有一部分 Negative 的细胞 FSC 和 SSC 值都很大我都不分析
了。你这个 50-60% 听起来有点吓人。或者你换一个染料来做这个实验，比如 DAPI？
如果 DAPI 的值和 7-AAD 的不一样说明两个药品当中有一个坏掉了。
AAD+ （做 FACS的时候离 trypsinization差不多5-6小时吧）。刚刚trypsinized的细
胞，然后立即作FACS， 7-AAD+的细胞比例很低，只有1-2%左右吧。 |
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f*******g
发帖数: 35 | 18 谢谢你的回复 !
7-AAD应该是好的,我的293T细胞从培养皿detach后立即用7-AAD染色,viability挺高的,
有95%左右吧。但我用抗体染色时间长，要3-4小时，最后作FACS，7-AAD+ 的细胞就达
到了50-60%。
在室温下温育的时候， 死细胞和活的细胞明显分成两个population， 死细胞FSC明显变小了。
我的PBS是从公司买的， 1X，但从来没有测过pH。
谢谢 |
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m*****u
发帖数: 15526 | 19 偶一直认为难转的细胞才用电转，293T这么容易转染的细胞用什么电转？ |
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e**r
发帖数: 1144 | 20 想查一下 293T 自己表达的miRNA有哪些
去哪里可以查 ? 有哪个paper比较全地列出来么? |
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b******y
发帖数: 627 | 21 I am over-expressing GFP-tagged protein in 293T cell and planning to IP
using anti-GFP antibody to see what interaction partners are pulled down.
Anyone can suggest the appropriate detergents and their concentrations for
breaking the cell while not interfering with protein-protein interactions?
Thanks a lot! |
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r******k
发帖数: 446 | 22 我试了试用293t细胞做cell fractionation，但是总是有cytosol的marker在nucleus的
extract里面。是不是这种细胞不好做呢？我用别的细胞做没那么严重。。。 |
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c********n
发帖数: 225 | 23 实验流程第一步：
1. Cell culture
更新前
293T cells are maintained in high-glucose DMEM (HyClone) supplemented with
10% FBS (HyClone) and penicillin/streptomycin at 37°C with 5% CO2
incubation. Cells are seeded to 24-well plate (Costar) with 60% confluence 8
hours before transfection. Thirty minutes before
transfection, cells are washed twice with PBS and medium is changed to high-
glucose DMEM medium containing 2% FBS.
更新后
293T cells are maintained in high-glucose DMEM (Gibco) supplemented with 10%
FBS (Gi... 阅读全帖 |
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t*********r
发帖数: 12 | 24 谢谢解答，我原来用293T细胞试过，该化合物对293T是有毒性的，还以为这个化合物对
肿瘤细胞的特异性没那么好呢。原来293T细胞也不能作为非癌细胞对照的
再麻烦问一个问题，要做正常细胞对照，是不是不能用那种永生的细胞系做呢？永生的
细胞系是不是都有癌细胞的一些特征呢？
谢谢~ |
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s******r
发帖数: 2876 | 25 293T本身应该是G418 resistant，不然它那个大T抗原怎么进去的。
HEK 293T 本身不带G418 抗性。
但是因为 293T可以不停的复制环状的质粒，所以不管是否稳定转染，都会有抗性，
会导致你很难筛选出被稳定转染的细胞。 |
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l**********n
发帖数: 240 | 26 最近做lentivirus， 用293T包装，取病毒，离心，然后感染平滑肌细胞。
发现感染后 有的dish中有293T细胞（形态上很好辨认）。
有人告诉我可以用0.4um filter过滤可以去除293T细胞，但是病毒滴度会降低。
大家有没有更好的办法？ |
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t**l
发帖数: 109 | 27 不过她们家的文章都很有意思，做神经行为方向，全是western blot 生化方向的。 很
少有组织学，生理学的实验。当然最后总会用一个行为学的实验来验证一下genetic
phenotypye,剩下的就是用生化解释pathway。感觉CELL老多都是这样的PAPER。起点都
是一个IN VIVO或者primary cell tissue, 中间做着做着，就看见293T cell, 然后
FLAG-TAG。我现在一看见有293T cell的文章，感觉都头大。那些生化PATHWAY用293T解
出来的，到底有多少是能真实的反应in vivo的生理。 |
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发帖数: 1 | 28 1 北京大学生命科学学院魏文胜课题组
我们使用了文章中报道的高效ssDNA，同时自己设计了其他2条针对体内其他基因位点的
ssDNA，与NgAgo表达质粒共转HEK293T细胞与HeLa细胞，2天及5天后，用T7E1检测切割
效率，这三条针对2个不同基因的ssDNA，在HEK293T和HeLa两个细胞系中，无论转染一
次还是在8到12小时后再转染一次ssDNA，都没有检测到切割。
针对敲除后能使细胞有表型变化的某特定基因，我们设计了ssDNA，与NgAgo表达质粒共
转HeLa细胞5天后，发现细胞表现出了一定的对应表型，但是把这部分细胞收集起来提
取基因组，对靶位点测序，没有发现基因组序列的任何改变。
我们针对某特定基因设计了6种ssDNA，用特异的荧光报告系统检测是否有靶点DSB产生
，结果显示所有实验组均没有检测到对靶位点DNA序列的切割活性。
2 中科院动物研究所王皓毅课题组
我们在293T细胞中表达带有Flag标签的NgAgo ，在不同时间点检测NgAgo蛋白表达。发
现转染6小时后开始检测到目的蛋白，随着时间的延长蛋白量增加。在人类293T细胞系
中重复原文章中Figure ... 阅读全帖 |
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t******y
发帖数: 716 | 29 表达一个人体蛋白的突变体。这个蛋白的突变体（pCDNA3质粒上）中有一个点突变在
293T细胞表达量检测不到（其他几个突变体都可以检测到）。所以想用体外表达系统来
表达，不知道有没有人用过这个系统，推荐一下哪个公司的产品比较好。
因为初步判断突变体影响蛋白结构，在293T细胞体内表达时可能被降解了。所以想通过
体外表达，防止降解发生。因为以前没有做个这个实验，所以有几个问题。
1）体外表达是否可以防止突变蛋白降解？
2）选择哪个来源的系统表达我的蛋白？源自human是否比源自wheat的系统或者yeast的
系统更容易降解我的蛋白？
3）打算用质粒DNA直接做，有什么要注意的情况？
4）市场上的kits，哪个比较好？
先谢谢了。 |
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J********3
发帖数: 3151 | 30 我们也是从addgene买的，因为没认真做这个，就是大概齐建立个方法以备将来用，还
真没观测过荧光，不过293T跟MEF表达水平差太远，肉眼几乎看不见荧光也正常，俺以
前用U2OS做GFP-tag的稳定细胞株，初期能看见很绿，到挑克隆时也基本看不清了，但
用FACS能sort。俺的primary MEF是3/48的iPS，比永生MEF少几倍，俺们lab另一个人是
0/96，俺也不大清楚他为啥就不灵。
实在不行，可以把培养基里加点GSK-3 inhibitor，俺加了2i，90%以上的胚ICM能诱导
出ES来，不加的话，也就30-50%的胚ICM能诱导出ES来，这个不是简单的两三倍差别，
应该是非常大的差别。
293T |
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s******y
发帖数: 28562 | 31 HEK 293T 本身不带G418 抗性。
但是因为 293T可以不停的复制环状的质粒，所以不管是否稳定转染，都会有抗性，
会导致你很难筛选出被稳定转染的细胞。 |
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l*****m
发帖数: 122 | 32 谢谢你的建议:)
具体说说我的virus载体和transduction的过程吧~
1> retrovirus用的是MSCV based带有mir155 backbone的一个载体（某postdoc自己构
建的）有GFP marker。因为它只侵染dividing cell, 所以就在collect BM的当天做一
次spin infection （用fresh virus containing sup from transfected 293T cells)
，之后两天各做一次spin infection，然后让细胞在有GMCSF的medium里面继续分化到
day7 (中间换一次medium). 最后收细胞染色FACS. 现在结果就是no virus control分
化没什么问题，通常我得到90％ CD11c+细胞，其中MHCII+大概15％；问题是无论是
control virus (empty vector)还是有target shRNA的virus，细胞就不表达CD11c了 (
<10%），MHCII到没怎么变，还看过CD86之类的co-stimulatory molecul... 阅读全帖 |
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D***y
发帖数: 693 | 33 最近开始用293Tproduce lentivirus，收集上清后过0.45um filter,然后Infect cells
。24小时后check GFP，只有很少的细胞gfp positive的，而且是一簇一簇的。看形态
像293T细胞，想问各位一下：0.45um filter 能把293T去掉吗？
多谢！ |
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L**********O
发帖数: 1761 | 34 Thank you, guys!
I transfect the primary cells with pGL and pRL-TK at the same time using
Lipofectamine. I haven't tried transfect the 293T cells. So do you think the
first thing I need to try is to transfect the 293T cells with these two
vectors at the same time?
I think the vectors are fine, esp. the pGL--- we bought it from promega :) |
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Z******5
发帖数: 435 | 35
1,Silencing NTCP inhibited HBV and HDV infection, while exogenous NTCP
expression rendered nonsusceptible hepatocarcinoma cells susceptible to
these viral infections.
Any other paper claimed to find HBV receptor also show data such like this
paper. Non of them are convinced enough. Hepatocarcinoma cell can
definitely bind the glycoprotein of HBV (tons of references) and some papers
claimed that low percent of epatocarcinoma cell could be infected by HBV.
It is looks like NTCP is just one of th... 阅读全帖 |
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Z******5
发帖数: 435 | 36
1,Silencing NTCP inhibited HBV and HDV infection, while exogenous NTCP
expression rendered nonsusceptible hepatocarcinoma cells susceptible to
these viral infections.
Any other paper claimed to find HBV receptor also show data such like this
paper. Non of them are convinced enough. Hepatocarcinoma cell can
definitely bind the glycoprotein of HBV (tons of references) and some papers
claimed that low percent of epatocarcinoma cell could be infected by HBV.
It is looks like NTCP is just one of th... 阅读全帖 |
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a*****n
发帖数: 2835 | 37 you can also use regular 293t if you feel hard to handle 293ft
I usually use 293t for profucing lentiviruses. I do not change medium before
transfection but change medium 24hours after transfection. |
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c****1
发帖数: 1095 | 38 慢病毒是可以感染293T细胞的。那么我们平时在包装慢病毒的时候，那些新包装的病毒
是不是会马上感染包装自己的293T细胞或者那些没有被转染的细胞？这样一来，是不是
会降低病毒的滴度，而且会造成转染效率100%的假象（应该被病毒感染的病毒也会表达
GFP）？ |
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r******k
发帖数: 446 | 39 Hi thx! 我带了一个RFP。 用的293t, 长的太快了。 果然是even water 也 growth的
293t. 但是现在细胞长的太满了，第一天也就80% confluence的样子。 现在传染的
efficiency也就40%。 |
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E*********4
发帖数: 16 | 40 知道本版的牛人非常多，全部大隐隐于市。希望各位大神能帮忙指出mammalian Hela
lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag
vector上面subclone到另一个lentivirus vector上，然后在Hela里面建立over-
expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒（在
293T里面可以检测到蛋白表达）。问题是empty vector很顺利，但是我们的蛋白没有办
法产生病毒，或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的
lentivirus expression vectors，同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒
性，于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白，还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做
subcloning的时候，缺了或者多了什么部件？插入的位点是在multiple cloning sites
. 我的insert只包括N Flag-Protein of interest，没有polyA ta... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 41 大家好，我分别用了来自韩春雨实验室的版本，自己将NgAgo移到PX330质粒的版本（前
后都加NLS），另外还有根据韩的文章给出的氨基酸序列，经过人源化密码子优化的版
本。三个版本分别与GFP的gDNA（韩paper里设计的gDNA）共染GFP阳性的293T stable
line，在293T细胞里做了韩春雨的G10 gDNA，在Cos7细胞里做了的TYR基因，另外还注
射了一大批卵，均无一个阳性结果。
在 2016年6月26日星期日 UTC+8上午4:28:02，。。。。 Zhou写道： |
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m****a
发帖数: 270 | 42 HEK293 不会，293T 和Cos 7 会，质粒里的SV40 enhancer 需要 SV40 large T
antigen 结合才能起作用，这个在293T 和Cos 7有表达。 |
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i***s
发帖数: 39120 | 43 韩春雨实验室所在的四层老楼新安装上智能门。
韩春雨论文中的关键实验环节。
韩春雨瘦了，一位接近他的人说，最近韩春雨经常做实验到凌晨两三点钟。
他的实验室在河北科技大学一座四层老楼里，红色的外墙伏满了爬墙虎，韩春雨在这一待就是10年。今年5月2日，一篇关于新基因编辑技术NgAgo的论文在国际顶级期刊《自然·生物技术》（Nature Biotechnology）在线发表（后在该刊第34册7月号纸质版发表），作者是河北科技大学副教授韩春雨领衔的课题组。发表后，不仅他个人，连他所在的实验室，都获得了前所未有的关注。为了安全，学校不得不给实验楼安装上刷卡入内的智能门，还布了摄像头。
韩春雨有两间研究室在三楼走廊的尽头。在接待过一波又一波记者，甚至有长江学者来访的房间里，一张白色纸片嵌在插座缝里，上面写着“Arrival of the Argonautes 1.0T and 2.0 Smart! （Ago1.0T和2.0Smart版本的到来！）”，后缀为两个笑脸。实验室在等NgAgo优化版2.0尽快问世。
但NgAgo1.0仍然摇摇欲坠。由于多个实验室无法重复实验，被认为可以超越时兴的CRISPR... 阅读全帖 |
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m**1
发帖数: 2 | 44 我想用Lentivirus介导针对某一基因ShRNA感染U2OS细胞以Knockdown该基因的表达，结
果是反复几次均未成功----感染U2OS细胞后用Puromycin筛选，细胞全部死亡。这说明
可能1）Lentivirus没有包装成功2）U2OS对Lentivirus敏感3）----？
我有该种Lentiviral表达质粒直接用Fugene
6转染U2OS细胞，然后用puromycin
筛选，有大部分细胞survival,说明Lentiviral表达质粒没有问题。
我包装Lentivirus的过程是：
Co-transfect下列质粒至 293T 细胞（用Fugene
6），48小时后，将上清液过滤，直接加到U2OS细胞上，48小时后加入Puromycin进行筛
选。
Lentiviral质粒 5ug
Gap 2ug
Rev 2ug
VSVG 2ug DNA总量 11ug, Fugene reagent 33ul.
第二次加大了DNA量，但还是不成功。
Lentiviral 质粒 10ug
Gap 3ug
Rev 3ug
VsVG 3ug DNA 总量19ug,Fugene 57 |
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d********f
发帖数: 43471 | 45 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: mahmet (里约大冒险), 信区: Biology
标 题: 知识分子独家专访：面对质疑的韩春雨
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Oct 17 21:05:25 2016, 美东)
独家专访：面对质疑的韩春雨
原创2016-10-18 陈晓雪、李晓明 知识分子
►韩春雨任教的河北科技大学门口。摄影：陈晓雪
内文提要：
独家专访：面对质疑的韩春雨
韩春雨NgAgo论文可重复性争议考验科学界
编者按：
5月初，《知识分子》以国际科学媒体的标准，第一时间报道依据国际科学同行
评议的学术刊物上发表的韩春雨论文以及当时多位科学家评论，并说明其是发展了荷兰
科学家的工作。此后，国内媒体和单位纷纷跟进，因为没有新的工作进展，《知识分子
》未继续报道。从网上开始有声音质疑韩春雨文章结果，《知识分子》一直保持追踪国
内外学术界最新的动态，但不依据私下匿名来源为主作报道，直到13位中国科学家公开
实名发言后，《知识分子》才有可以较为完整、公开的事实可以报道。
NgAgo实验的可重复性争议历经数月之... 阅读全帖 |
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p*******e
发帖数: 3 | 46 病毒被消耗了吧。被感染的细胞不可以再复制病毒了吧。 |
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D***a
发帖数: 516 | 47 那我的shRNA这个情况，应该是消耗减少了，得到的病毒应该更多啊。 |
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r***e
发帖数: 2539 | 48 有可能。
另外看一下你的载体有没有重组，掉了一段，影响包装。
但是单独转染看不出问题。lenti很容易重组的。 |
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s********s
发帖数: 84 | 50 测基本上是，是把得到的virus稀释后 infect细胞 然后用抗生素blasticidin 选出来
有抗性的以后 染色 数有多少colony。
载体重组了。。如果是这个原因 有啥办法呢。。只能换载体么。。
to neverthink 更多的细节啊
是用PENTR3C （里面有表达目标蛋白的gene）
然后和 plenti6/V5-DEST 做LR recombination
得到colony做酶切 看看位点之类的对不对
最后得到plasmid （用来做transfection之类的能得到蛋白表达）
用这个plasmind然后和pLP1, pLP2, pLP/VSVG之类的一起transfection 293T 细胞
得到virus
然后infection 然后检测蛋白没有。。
曾经用同样的办法做了几批virus，曾经有一批是能检测出来的。
但是后来我再做就不行了= =
反反复复几次以后 老板就让我重做一遍vector 就是从PENTR3C和自己目标蛋白gene 酶
切，ligation那步开始重做。也不说为啥要这样。一摸一样的方法重做一遍会有啥改变
么。。
PENTR3C这个原始的载 |
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