s*****t
发帖数: 107 | 1 PEI mixture 1ml ??
incubate 4 hour, then take them out
and add new fresh medium. for gfp, the effienciency should be around 80%. |
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l********e
发帖数: 636 | 2 for 60mm plate, 5ml pei mixture. for 6-well plate, 0.5 ml per well. |
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s*****t
发帖数: 107 | 4 请给个5ml（60mm plate）PEI mixture的配方。多谢~~ |
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l********e
发帖数: 636 | 5 写错了， 应该是10cm, 5ml. the original con of PEI is 10mm. dilute 1000.
prepare 2.4ml DMEM with 0.1ml pei. prepare DNA mixture with 2.5ml DMEM with
DNA. add PEI mixture to DNA mixture dropwise, incubate at RM 20m, then take
the medium out from the plate and add the mixture. after 3-4hour incubate.
take the mixture out and add fresh medium. |
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s*****t
发帖数: 107 | 6 DMEM是没有antibiotics和Serum的吧？
with
take
. |
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p******i
发帖数: 1092 | 7 我把TLR4 cDNA (2.6kb)从macrophage里PCR出来，加上XhoI和BamHI，接到
pEGFP-N1里，测序结果也是正确的，就是TLR4后面接了个in frame fusion的EGFP
但问题是transfect到293T里不亮，而空载体pEGFP-N1很亮……
我现在怀疑是kozak不够强，准备在ATG前面加一个
GCCACCATGGXX，不知道会不会有帮助……
哪位做过类似的实验，请不吝赐教啊，
在下先谢过了…… |
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Z******5
发帖数: 435 | 8 养了一年半细胞了，从来没有用过抗生素，也没有污染过。
另外我转染都用罗氏的FuGene HD，不用换液，操作简单。 我们实验室转293T的都用这
个。 |
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l******g
发帖数: 1623 | 9 293T 平均16个micron，过不了filter的。过滤完你看一下就知道了。
你看到的是你后来感染的细胞吧？
cells |
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D***y
发帖数: 693 | 10 用的是vsvg。不知道为什么包转效率很低。转293T后看了一下gfp,很多细胞是positive
的。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 11 “很多”是不够的，基本上293T转染的效率应该达到至少90%以上
positive |
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L**********O
发帖数: 1761 | 12 yes~~~
0.45um filter 能把293T去掉吗？ |
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d**********2
发帖数: 103 | 14 小弟想向各位大虾问一下caspase 3/7 的问题：）
用得是promega 的 Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay kit
小弟想 用不同GFP融合蛋白转染293T 细胞然后用这个KIT监测Caspase-3/7 的活性 但
是结果很奇怪
用Staurosporine(10uM, 5H)诱导细胞凋亡所产生的信号比GFP空载转染的细胞的信号还
低。。。
所以想问问到底是什么问题。。。 |
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p******i
发帖数: 1092 | 15 计划做一个protein的tetramer，然后用tetramer做binding.
思路是：
1) express protein from 293T supernatant，purify by HIS column
2）in vitro biotinylation by BirA biotin ligase (site-specific)
3) add streptavidin-PE to make TETRAMER
请问大家觉得我这个思路可以吗？
哪位做过TETRAMER的，还请不吝赐教啊～～～多谢了～～～
另外，能请各位看看下面的内容给提点意见吗？因为克隆测过序没问题，但是现在还没
看到secretion的表达 = =
在protein的N端加上：
kozak-preprotrypsin signal peptide（for secretion，貌似这样产量会高一些，而
且可能提纯好做一些）, AviTag peptide (AviTag 是BirA ligase的识别site，可以用
来做site specific的biotinylation)
preprotrypsin ... 阅读全帖 |
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p******i
发帖数: 1092 | 16 我试着在protein前面加了pFLAG-CMV-1的preprotrypsin leader sequence,
protein后面有6HIS tag.
transfect 到293T 里后，收media和lysate
直接跑western:lysate里面看到了，但是Media里没看到
Purify by Ni column,lysate和media里都没看到……
想请问一下大家如果想让蛋白分泌到media里，是如何做到的？ |
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d**********2
发帖数: 103 | 17 大虾们好。。。
小弟最近在转染293T来筛选能激活CASPASE3 的蛋白。。。
先是用了promega 的Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay来检测caspase 3
激活。。。
但是负对照和staurosporin 处理的细胞没有区别。。。
转而用santa cruz 的caspase 3 抗体（caspase-3 (H-277): sc-7148）检测p17/p19
也未果。。。只能见到全场的
caspase 3 。。。staurosporin 浓度1ug/ml, 5H 。。。都可以看到细胞明显的形态变
化了。。。甚至看到细胞内很多小
泡泡。。 (凋亡小体)？...
迷茫啊。。。各位觉得是抗体/试剂盒/细胞株还是staurosporin有问题呢？请各位不吝
赐教啊。。。。
谢谢～～ |
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Z******5
发帖数: 435 | 19 你这个值也太低了吧。读数大小和荧光收集时间的设置有关，我一般设置收集2秒，自
己用移液枪加液（没钱，剩），每次就测3个well的。具体：
背景值：黑板40左右，白板100左右
Firely的值从几万（转染效率低的细胞）到几千万（293T细胞）；Renilia的值从几百
到几万（我用的是pRL-TK载体做内参，转的相对较少）
你的明显有问题（当然前提是问题不是出在你用的promoter上），建议你在你用的cell
line和293细胞中同时转染pGL3 control，pGL3 Basic，和pRL-TK载体，然后测荧光值
，看看你的试剂，测试程序等有没有问题。 |
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B******o
发帖数: 496 | 20 你先确认一下你的primary cell能被transfect不。
其实大部分的DLA都是在293T里做的，你用primary cell有啥原因么？
the |
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j****x
发帖数: 1704 | 21 293T/293FT可以很容易到90%以上，293不太容易，70-80%是正常的 |
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s******y
发帖数: 28562 | 22 你是想要表达外源的ICAM-1？ 还是你想要那个悬浮细胞本身就表达ICAM-1？
如果是前者，你可以用HEK 293T, 如果是后者，那我不知道 |
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m******5
发帖数: 1383 | 23 你用的什么cell line? Hela好像特别容易进核，换NIH3T3或者293T试一下
不过楼主你做这个NES的目的是干嘛？ |
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o**4
发帖数: 35028 | 24 一般情况下，我用293T做病毒的时候，效率很高的，
这次，大部分细胞都没有荧光，不知道是转染的问题，还是病毒不能包装不能反复感染
细胞？ |
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s******r
发帖数: 2876 | 25 怎么知道你293时候病毒效率很高？
一般情况下，我用293T做病毒的时候，效率很高的，
这次，大部分细胞都没有荧光，不知道是转染的问题，还是病毒不能包装不能反复感染
细胞？ |
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o**4
发帖数: 35028 | 27 我的质粒有18kb，
转染293T，western没有检测到表达，
是不是转染有问题？ |
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S*****s
发帖数: 287 | 28 我转的也是 293T。刚开始也没指望能成，不过我的 BAC 上带了一个单独表达的 GFP，
所以就试了一把，没想到效率很高。显微镜下一看绿油油的。不过 DNA 的量要把握好
，我一般就转 10 微克以内，再多就容易看到沉淀了。就这个量不管是做 Western 还
是 real-time 都够了。 |
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a*******u
发帖数: 19 | 32 A-CFP和B-YFP（或B-CFP&A-YFP）共转HEK293T，COS7，使用lipofectamine 2000转染（
按说明书操作）48小时后，细胞中只有A-CFP或B-YFP，但是没有2个蛋白一起表达的细
胞。A在80 kD左右，B在90kD左右，是不是A和B蛋白太大，两个不容易一起表达？如果
将用A的剪切体约45kD再和B全长去做FRET估计能共表达吗？
Hela里共转Flag-A和His-myc-B的时候A表达很低，所以就没试；293T和COS7中Flag-A和
His-myc-B共转都没问题。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 33 新一代lentivector中很多都带这个SV40 ori，在293T细胞中支持episomal DNA
replication，理论上对提高病毒titer肯定有好处。retroviral vector中最早的报道
是可以提高病毒滴度up to 2 logs，lentivector上的数据我不是太清楚 |
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B****n
发帖数: 22 | 34 我也找一个能替代293的，容易转染又贴壁比较结实的。做lentivirus的时候每次都要
小心翼翼的加培养基，很不爽。
能用cos7直接替换293T么做lentivirus么？ |
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j******1
发帖数: 1315 | 35 包Lentivirus，但是如果用来感染Stem cell血清会对Stem Cell 有影响吧？才想到，
各位大侠该怎么办？ |
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m*****z
发帖数: 1451 | 37 concentrate virus and resuspend in PBS |
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z*t
发帖数: 863 | 38 use the serum containing medium is OK, we do MSCV all the time. As long as
your virus containing medium don't exceed 1/3 of final volume, then it's OK |
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m*****z
发帖数: 1451 | 39 depends on the stem cell you want to transduce
as
OK |
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s**a
发帖数: 293 | 40 re
有些stem cell本身的培养基也是有血清的 |
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e**r
发帖数: 1144 | 41 CHO K1细胞，前一天用150uM H2O2处理过，养了一天，大部分细胞漂起来了，剩下贴壁
的细胞在相差显微镜下看大部分都有两团亮的东西在核的两侧
之前也看到过一次这种东西，那次是因为在DMEM里养了几天，大概是因为没有proline,
所有细胞都变成了这个样子。换成F12养了一天就恢复正常形态了。
谁知道这种亮的东西是什么结构？ 低倍用眼睛看似乎是一些小泡构成的簇
Hela, 293T上没见过这种东西。 |
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m**********d
发帖数: 137 | 42 之前做过很多lentivirus，都是超速离心virus之后infect细胞，transduction效率都
还不错，这次偷懒没离心，直接用的含有病毒的medium，可是puromycin select一两天
后细胞全死光了，以下是详细的protocol:
vector用的是pBABE-Luc （基于pBABE-puro,只不过也表达luciferase）
293T细胞，养在75cm2 flask里，用lipofectamine2000转染的，包装病毒用的是second
generation packaging system (PAX2,pMD2.G)
分别于转染后48hr和72hr collect medium，过了一下0.45uM的filter，又加了8ug/ml
的polybrene，就加到要transduce的细胞里去了，24hr之后开始puromycin selection
我能想到的问题可能是准备transduce的细胞有点太confluent了，但这也没法解释全死
光的结果，我想很可能是没有病毒包装，高人们帮忙看看这过程中可能是么出了问题 |
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B****n
发帖数: 22 | 43 the cell survived your selection. so your lentivirus works fine.
you may extract the DNA from the infected cell to see if your cDNA is still
there or not.
If i remember correctly, when you transfected 293T cells, the region between
the 2 LTR region will be transcribed and spliced. when the lentivirus
infects cells, the virus genome(RNA) will be retrotranscribed into DNA and
integrated into genome. So if there is any intron or intron like structure
in your contruct, it maybe processed as an intro... 阅读全帖 |
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s*****i
发帖数: 315 | 44 HEK293 是人胚肾细胞，应该是间质细胞或是上皮细胞来源的永生化细胞系
293T是经过largeT antigen transform的 HEK293 细胞系 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 45 do you also have untransfect 293T and how many bands on it? |
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b**********8
发帖数: 349 | 46 能包装慢病毒的，knockdown效率高的，能否给个sequence和vector的信息？最近整这
个，用的plenti lox3.7，在sigma的网站上抄了4条shRNA,买回来自己退火连接做克隆
，转到293T里面，western blot发现都没效果，郁闷死了。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 47 非常谢谢！ 我们准备订购的合成的多肽末端是有N-acetylation 的（所以不敢在
太小的公司那里订）， 而那个GST fusion万一真的需要做的话也准备在293T cell里面
制备
你知道得很多啊，谢谢。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 48 Sure
plus
Ku GM et al. (2012)
An siRNA screen in pancreatic beta cells reveals a role for Gpr27 in insulin
production.
PLoS Genet. 8: e1002449.
Abstract
ignored
We show that knockdown of Gpr27 reduces endogenous mouse insulin promoter
activity and glucose stimulated insulin secretion. Furthermore, we show that
Pdx1 is important for Gpr27's effect on the insulin promoter and insulin
secretion. Finally, the over-expression of Gpr27 in 293T cells increases
inositol phosphate levels, while knockdown... 阅读全帖 |
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f*c
发帖数: 2726 | 49 说实话，我真是想骂她，日本人，有时候我真觉得这人有毛病，要么就是更年期。
有一次某样试剂用的很快，她就一直怀疑是新来的薄厚把它洒了。还有一次，我用完离
心机后她用，她觉得有问题，我觉得没问题，她不放心，叫人来检查，检查的人说没问
题，然后她接着用，结果短路了，来检查的人大概把线路接错了，她说她很伤心。我特
幸灾乐祸。
要说，她也是senior scientist了，发了不少cell, 最近做 plasmid transfection to
293T,一直没成功，然后怀疑我给她的细胞有问题，我说没问题，因为我transfection
没问题，后来说她没有在转染前一天传细胞，她把细胞传得很稀，然后等到2-3天后细
胞多起来，再转。我觉得这也算是低级错误了。 |
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F*K
发帖数: 608 | 50 转了一个质粒到293T，免疫荧光定位在核内的网状结构 （附图，左。 右边是DAPI）
请问这是什么结构呢，谢谢 |
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