m*********D
发帖数: 1727 | 1 如果PCR的template里包含WT和mutant（十来个Nt不一样，包含一个酶切位点。），PCR
出来的产物有1Kb，mutation就在这个PCR产物的中间。PCR产物用这个酶切后，上gel,
mutant都是两个片段，跑得快；WT没切该不变。分离这些片断就可以sequence.
问题是，就算酶切完全，WT那个band里面会不会有一条链是WT，一条Mutant的DNA分子
？而这样的DNA正好不能被酶切。因为两条链差别不大，在PCR的变形/退火过程里可能
形成这样的一条链是WT，一条Mutant的DNA分子。这样送去sequence,这个WT可能因此不
能被confirm?
碰到了上面的问题，还在为是不是酶切不全，还是这种一条链是WT，一条Mutant的DNA
假设而烦恼。 |
s******r
发帖数: 1245 | 2 PCR结束难道额外做了一步变性退火，或者样品放太久了？新做的双链合成结束除非
polymerase error哪里来的hybrid。担心酶切不完全的要做的精细点吧band切出来做ta
cloning送去测序。大款的直接上miseq
PCR
,
DNA
【在 m*********D 的大作中提到】
: 如果PCR的template里包含WT和mutant（十来个Nt不一样，包含一个酶切位点。），PCR
: 出来的产物有1Kb，mutation就在这个PCR产物的中间。PCR产物用这个酶切后，上gel,
: mutant都是两个片段，跑得快；WT没切该不变。分离这些片断就可以sequence.
: 问题是，就算酶切完全，WT那个band里面会不会有一条链是WT，一条Mutant的DNA分子
: ？而这样的DNA正好不能被酶切。因为两条链差别不大，在PCR的变形/退火过程里可能
: 形成这样的一条链是WT，一条Mutant的DNA分子。这样送去sequence,这个WT可能因此不
: 能被confirm?
: 碰到了上面的问题，还在为是不是酶切不全，还是这种一条链是WT，一条Mutant的DNA
: 假设而烦恼。
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m*********D
发帖数: 1727 | 3 到最后那个cycle,不会每个DNA strand都会被用来作template吧？我从gel下来了，送
seq,就那个mutation区间不清楚，所以有此一问。还在作第二次酶切呢。
不就是想省事么。mutant band到还行，没问题。这个不酶切的WT band让我头疼呢。
ta
【在 s******r 的大作中提到】
: PCR结束难道额外做了一步变性退火，或者样品放太久了？新做的双链合成结束除非
: polymerase error哪里来的hybrid。担心酶切不完全的要做的精细点吧band切出来做ta
: cloning送去测序。大款的直接上miseq
:
: PCR
: ,
: DNA
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s******r
发帖数: 1245 | 4 一般设计实验都是让想看的东西切出来，你设计成看不切的话就省不了事
不切的band是很可能不纯，直接送测吧，说不定就测出来了，fail的话就cloning才测呗
有十几个nt的差别弄两条不一样的pcr引物用pcr鉴定不是更简单直观，还整酶切干吗
【在 m*********D 的大作中提到】
: 到最后那个cycle,不会每个DNA strand都会被用来作template吧？我从gel下来了，送
: seq,就那个mutation区间不清楚，所以有此一问。还在作第二次酶切呢。
: 不就是想省事么。mutant band到还行，没问题。这个不酶切的WT band让我头疼呢。
:
: ta
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D*a
发帖数: 6830 | 5 PCR永远不会纯，如果是sanger测序法，你一条500的，和一条250的，都会形成sanger
测序的产物。最好你酶切完了跑完胶之后，再nest pcr一下，这样你的酶切断的DNA就
不会形成带，终产物就纯了。而且你没发现pcr都会形成一条亮带么，那就是乱七八糟
的扩增出来的东西。
不过，如果你要用这种方法，不要用35 cycles的终产物稀释n倍，用十来个cycle的产
物，不要跑胶，直接拿去切，切完了直接nest pcr，然后跑胶纯化nest pcr的产物。这
样是为了防止你的pcr造成几个突变分子，而你稀释太多倍就很可能恰好碰到那几个突
变分子。
我们做过类似的测序，不过我们没有酶切这一步。所以酶切这一步是我理论上觉得应该
是这样，如考虑不全面请指正。但是其他的nest pcr和减少cycle都是我们做过的。 |
D*a
发帖数: 6830 | 6 ps 测pcr产物，需要多送几个样品，因为虽然只有少数几个分子有随机突变，不会看出
来，但是因为如果这几个突变恰好在第一二个cycle，你就哭了...
我现在已经忘了当时用的是什么酶了，但是应该不是高保真的酶，因为我们平常做
genotype就用那个，没有新买，而且我记得我老板还特别说过一句没必要用高保真的..
. |
D*a
发帖数: 6830 | 7 也许可以把10个cycle的和35个cycle的一起跑胶，照着旁边那个的位置切？
sanger
【在 D*a 的大作中提到】
: PCR永远不会纯，如果是sanger测序法，你一条500的，和一条250的，都会形成sanger
: 测序的产物。最好你酶切完了跑完胶之后，再nest pcr一下，这样你的酶切断的DNA就
: 不会形成带，终产物就纯了。而且你没发现pcr都会形成一条亮带么，那就是乱七八糟
: 的扩增出来的东西。
: 不过，如果你要用这种方法，不要用35 cycles的终产物稀释n倍，用十来个cycle的产
: 物，不要跑胶，直接拿去切，切完了直接nest pcr，然后跑胶纯化nest pcr的产物。这
: 样是为了防止你的pcr造成几个突变分子，而你稀释太多倍就很可能恰好碰到那几个突
: 变分子。
: 我们做过类似的测序，不过我们没有酶切这一步。所以酶切这一步是我理论上觉得应该
: 是这样，如考虑不全面请指正。但是其他的nest pcr和减少cycle都是我们做过的。
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m*********D
发帖数: 1727 | 8 我是两个都看的。切出来的是mutant, seq也确认了。想的是wt band就一起从胶上回收
，seq就解决了。结果是在mutation区间太多杂峰。：（。
还试最后一次。不行就克隆去。谢谢！
测呗
【在 s******r 的大作中提到】
: 一般设计实验都是让想看的东西切出来，你设计成看不切的话就省不了事
: 不切的band是很可能不纯，直接送测吧，说不定就测出来了，fail的话就cloning才测呗
: 有十几个nt的差别弄两条不一样的pcr引物用pcr鉴定不是更简单直观，还整酶切干吗
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m*********D
发帖数: 1727 | 9 哦，我这个是template里就有两种：wt/mutant。PCR后产物一起digestion，指望
mutant变成两条带，从gel上纯化回收seq. 没切的band也从gel上回收后送seq。如果酶
切完全，又没有一条strand是mutant/一条strand是wt的DNA（我想这种DNA酶切不了）
，我就省了好多事呢。结果seq出来，在mutation区间有很多杂峰，就怀疑要么酶切不
完全或一条strand是mutant/一条strand是wt的DNA存在了。
再切一次，不行就只好克隆了。：（。
谢谢！
sanger
【在 D*a 的大作中提到】
: PCR永远不会纯，如果是sanger测序法，你一条500的，和一条250的，都会形成sanger
: 测序的产物。最好你酶切完了跑完胶之后，再nest pcr一下，这样你的酶切断的DNA就
: 不会形成带，终产物就纯了。而且你没发现pcr都会形成一条亮带么，那就是乱七八糟
: 的扩增出来的东西。
: 不过，如果你要用这种方法，不要用35 cycles的终产物稀释n倍，用十来个cycle的产
: 物，不要跑胶，直接拿去切，切完了直接nest pcr，然后跑胶纯化nest pcr的产物。这
: 样是为了防止你的pcr造成几个突变分子，而你稀释太多倍就很可能恰好碰到那几个突
: 变分子。
: 我们做过类似的测序，不过我们没有酶切这一步。所以酶切这一步是我理论上觉得应该
: 是这样，如考虑不全面请指正。但是其他的nest pcr和减少cycle都是我们做过的。
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D*a
发帖数: 6830 | 10 我说的就是这个啊，就是因为你pcr分离不可能纯，所以只能靠nest pcr解决，这样让
第二次的pcr产物只有一种，来解决跑胶分离不完全的问题。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 哦，我这个是template里就有两种：wt/mutant。PCR后产物一起digestion，指望
: mutant变成两条带，从gel上纯化回收seq. 没切的band也从gel上回收后送seq。如果酶
: 切完全，又没有一条strand是mutant/一条strand是wt的DNA（我想这种DNA酶切不了）
: ，我就省了好多事呢。结果seq出来，在mutation区间有很多杂峰，就怀疑要么酶切不
: 完全或一条strand是mutant/一条strand是wt的DNA存在了。
: 再切一次，不行就只好克隆了。：（。
: 谢谢！
:
: sanger
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m*********D
发帖数: 1727 | 11 我不知道你说的“不纯”是指那种情况：1。PCR产生的non-specific product,大小也
和specific产物一样；2。就是我说的那种一个DNA分子的两条链不match,一条是mutant
, 一条是wt。
前者有strategy可以对付：另用一个specific的sequence primer，而不用PCR里用的两
个primers之一。你说的Nested PCR思维上基本差不多，也可以，就多一步PCR。
后者是我担心的，nested PCR不能解决我的问题。我的mutant和wt用同一个非PCR的
specific sequencing primer。
【在 D*a 的大作中提到】
: 我说的就是这个啊，就是因为你pcr分离不可能纯，所以只能靠nest pcr解决，这样让
: 第二次的pcr产物只有一种，来解决跑胶分离不完全的问题。
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D*a
发帖数: 6830 | 12 就是你的产物，里面不是说对着500bp的就都是500bp的，其实有很多其他的不是500的
，被trap到里面，最优势的带当然就是你切碎了的了。
都是双链的，而不是说杂合链。
mutant
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我不知道你说的“不纯”是指那种情况：1。PCR产生的non-specific product,大小也
: 和specific产物一样；2。就是我说的那种一个DNA分子的两条链不match,一条是mutant
: , 一条是wt。
: 前者有strategy可以对付：另用一个specific的sequence primer，而不用PCR里用的两
: 个primers之一。你说的Nested PCR思维上基本差不多，也可以，就多一步PCR。
: 后者是我担心的，nested PCR不能解决我的问题。我的mutant和wt用同一个非PCR的
: specific sequencing primer。
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m*********D
发帖数: 1727 | 13 理论上讲，gel就是按分子大小来分离DNA的呀。你这种一条链少了几百个bases的，应
该在gel上分开呀。
样品送出去了，这是最后一次。再不成功就换方法。这次的样品是上次酶切gel回收的
样品，再酶切在gel。倒是奇怪，gel上有一条细小的大分子量的条带。希望这是酶bind
上去后切不开，就一直结合在DNA上的，象gel-sift Assay出现的情况，把我担心的那
种一条是mutant，一条是wt的DNA分离出去了。
谢谢讨论！
【在 D*a 的大作中提到】
: 就是你的产物，里面不是说对着500bp的就都是500bp的，其实有很多其他的不是500的
: ，被trap到里面，最优势的带当然就是你切碎了的了。
: 都是双链的，而不是说杂合链。
:
: mutant
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D***a
发帖数: 516 | |
m*********D
发帖数: 1727 | 15 Good idea! 等结果，不行可以试试你这个。这个不match的在中间，切了应该可以在
gel上分离出去。
【在 D***a 的大作中提到】
: 用t7 endonuclease切一下？
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D*a
发帖数: 6830 | 16 我这不是给你说实际上不是这样的吗？
晕...
【在 m*********D 的大作中提到】
: 理论上讲，gel就是按分子大小来分离DNA的呀。你这种一条链少了几百个bases的，应
: 该在gel上分开呀。
: 样品送出去了，这是最后一次。再不成功就换方法。这次的样品是上次酶切gel回收的
: 样品，再酶切在gel。倒是奇怪，gel上有一条细小的大分子量的条带。希望这是酶bind
: 上去后切不开，就一直结合在DNA上的，象gel-sift Assay出现的情况，把我担心的那
: 种一条是mutant，一条是wt的DNA分离出去了。
: 谢谢讨论！
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m*********D
发帖数: 1727 | 17 塞，我也是委婉地说你这个说法没有理论根据呀。：（。
【在 D*a 的大作中提到】
: 我这不是给你说实际上不是这样的吗？
: 晕...
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D*a
发帖数: 6830 | 18 你不信就算了呗...
反正我老板亲自做转基因老鼠的时候是这么做的...
你自己觉得wt/mt杂一起挺稳定也就罢了，你说说一条DNA中间鼓起一块来还能跑得赶上
wt/wt的带的理论依据又是啥？
【在 m*********D 的大作中提到】
: 塞，我也是委婉地说你这个说法没有理论根据呀。：（。
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m*********D
发帖数: 1727 | 19 这这这。。。怎么听起来象小伙伴打架，打不过了就找爹爹一样。。。。：）。你老板
要是新的AP,bench上的你可以听听。拿到tenure后你就随便听听。我老板和学生讨论
bench上的tech,都市线咨询我的。
我的理论依据就是gel按DNA size来分的。单链DNA跑胶的快慢会和二级结构有关，只能
用denatured gel,但双链基本是按size来分的。我这个wt和mutant是九百多个Nt里面中
间有十来个nt变化，应该基本上是维持双链。我还每看有没有G：T配呢，要有几个GT配
，那就差别更小了。
【在 D*a 的大作中提到】
: 你不信就算了呗...
: 反正我老板亲自做转基因老鼠的时候是这么做的...
: 你自己觉得wt/mt杂一起挺稳定也就罢了，你说说一条DNA中间鼓起一块来还能跑得赶上
: wt/wt的带的理论依据又是啥？
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