c*******e
发帖数: 5818 | 1 有一个allele，我们做了TALEN，因为没有合适的限制性酶，用了T7, T7 indicate 可
能有“indel"，我的问题是，如何确认这个”indel"，不知直接deep sequence之类可
以不，不太想做PCR TA clone，然后做regular sequence。谢谢。 |
l***y
发帖数: 638 | 2 可以
不知道怎么搞的话george church有个protocol
http://bioinformatics.oxfordjournals.org/content/early/2014/06/
tics.btu427.full.pdf
【在 c*******e 的大作中提到】
: 有一个allele，我们做了TALEN，因为没有合适的限制性酶，用了T7, T7 indicate 可
: 能有“indel"，我的问题是，如何确认这个”indel"，不知直接deep sequence之类可
: 以不，不太想做PCR TA clone，然后做regular sequence。谢谢。
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j******i
发帖数: 939 | 3 t7是很可靠的。不放心的话可以把pcr条带做sanger测序，然后用tide分析. http://tide.nki.nl。tide是用来分析CRISPR的，不过调整一下参数也能看出有没有indel. 直接上deep sequencing的话, 我只能说有钱，任性！ |
h****n
发帖数: 333 | 4 同意，TALEN完全没必要用deep sequencing的方法确认indel，就普通的PCR条带直接
sanger测序然后分析足够了
序列分析用MutationSurveyor也可以看indel
deep sequencing不止是有钱任性，看indel还不如普通的sanger测序准确，何苦
【在 j******i 的大作中提到】
: t7是很可靠的。不放心的话可以把pcr条带做sanger测序，然后用tide分析. http://tide.nki.nl。tide是用来分析CRISPR的，不过调整一下参数也能看出有没有indel. 直接上deep sequencing的话, 我只能说有钱，任性！
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c*******e
发帖数: 5818 | 5 先谢谢大家，我去研究研究你们的建议。
我的问题是PCR是mixture，估计也就<10%的 indel，所以要灵敏度高些的方法。
我现在想跑一个page gel，因为indel估计要induce size difference，这个要是行，
比较简单，直接对比WT。想过SSCP，但要麻烦些。
【在 h****n 的大作中提到】
: 同意，TALEN完全没必要用deep sequencing的方法确认indel，就普通的PCR条带直接
: sanger测序然后分析足够了
: 序列分析用MutationSurveyor也可以看indel
: deep sequencing不止是有钱任性，看indel还不如普通的sanger测序准确，何苦
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c*******e
发帖数: 5818 | 6 MutationSurveyor，这个看起来不错，谁有经验的给说说可靠不。
【在 c*******e 的大作中提到】
: 先谢谢大家，我去研究研究你们的建议。
: 我的问题是PCR是mixture，估计也就<10%的 indel，所以要灵敏度高些的方法。
: 我现在想跑一个page gel，因为indel估计要induce size difference，这个要是行，
: 比较简单，直接对比WT。想过SSCP，但要麻烦些。
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s******r
发帖数: 1245 | 7 deep sequencing适合做量大的，几个sample的做划不来，多到几十上百个sample的话
比其他方法都便宜 |
c*******e
发帖数: 5818 | 8 我已经放弃这个想法，同意你说的
【在 s******r 的大作中提到】
: deep sequencing适合做量大的，几个sample的做划不来，多到几十上百个sample的话
: 比其他方法都便宜
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h****n
发帖数: 333 | 9 我自己就用过呀，不好用不会向你推荐的：）
我做的TALEN alleles都是用这个软件看的
不相信的话手动检查一下，一般都是对的，除非测序结果太难看
【在 c*******e 的大作中提到】
: MutationSurveyor，这个看起来不错，谁有经验的给说说可靠不。
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h****n
发帖数: 333 | 10 啊，你是说你要看注射TALEN以后的第一代吗？那个确实没办法直接PCR测序，本来就是
各种indel的混合。我说的是outcross以后拿到单一allele以后的办法。
其实PCR以后TA cloning以后再sanger测序不难啊，也就顶多一个礼拜的工作量。
用HRMA的办法就可以不用测序了，省事很多。反正第一代本来就是mixture，无所
谓立刻知道到底有哪些indel。outcross以后拿到稳定单一hets再测序确定好了
你们实验室如果有能做HRMA的仪器也行,不差钱就买一台，不然到别的实验室蹭机子用
也成啊lol
【在 c*******e 的大作中提到】
: 先谢谢大家，我去研究研究你们的建议。
: 我的问题是PCR是mixture，估计也就<10%的 indel，所以要灵敏度高些的方法。
: 我现在想跑一个page gel，因为indel估计要induce size difference，这个要是行，
: 比较简单，直接对比WT。想过SSCP，但要麻烦些。
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c*******e
发帖数: 5818 | 11 谢谢你，
这个HRMA是high resolution melting analysis吗？
【在 h****n 的大作中提到】
: 啊，你是说你要看注射TALEN以后的第一代吗？那个确实没办法直接PCR测序，本来就是
: 各种indel的混合。我说的是outcross以后拿到单一allele以后的办法。
: 其实PCR以后TA cloning以后再sanger测序不难啊，也就顶多一个礼拜的工作量。
: 用HRMA的办法就可以不用测序了，省事很多。反正第一代本来就是mixture，无所
: 谓立刻知道到底有哪些indel。outcross以后拿到稳定单一hets再测序确定好了
: 你们实验室如果有能做HRMA的仪器也行,不差钱就买一台，不然到别的实验室蹭机子用
: 也成啊lol
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c*******e
发帖数: 5818 | 12 做HRMA， PCR 是不是得gel purification?
【在 c*******e 的大作中提到】
: 谢谢你，
: 这个HRMA是high resolution melting analysis吗？
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h****n
发帖数: 333 | 13 是
【在 c*******e 的大作中提到】
: 谢谢你，
: 这个HRMA是high resolution melting analysis吗？
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h****n
发帖数: 333 | 14 你先看看能不能找到做HRMA的机器吧，不是一般实验室的常规配置
如果有的话，按说明书操作
对于多数没有这个机器的实验室，TA克隆了再测序没什么不好
最后，子一代因为是mixture，真心不用搞清楚到底是怎样的indel，只要用各种方法确
定确实有indel就可以了，具体的等outcross以后再测序确认
【在 c*******e 的大作中提到】
: 做HRMA， PCR 是不是得gel purification?
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