发帖数: 1 | 1 It's an interesting question. To the best of my knowledge, no RNA-seq
alignment tool was designed to tolerate CRISPR-mediated indels to date. I'm
not an RNA-seq expert, so it's possible that there are some on the way. You
can also email Luca Pinello, the author of CRISPResso. He might know more,
and he's a really nice guy.
Here I'm trying to think about a solution. There are two situations - I don'
t know which one is your case.
a) The sample for RNA-seq was derived from a single mutant clone. I... 阅读全帖 |
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j*p
发帖数: 411 | 2 攒人品，顺便回答一下 iiiir 的问题。
我们尝试过好几种不同的SNP calling的方法，包括GATK, Samtools, Varscan,
SeqGenes, 等，并且做了SNP array 作为gold standard比较各种方法的prediction
power。
从我们的经验，BWA + GATK 最好，sensitivity 和 specificity 都在95%以上。
以下是GATK 的pipeline
假设你有一个control 样品C 和一个样本样品A的pair-end sequencing，共4个文件，C
_R1.fastq, C_R2.fastq, A_R1.fastq and A_R2.fastq如何通过BWA/GATK去找样品A中
的SNPs (相对于C)
假设assembly 用的是hg19，你的BWA index 在这里：/bwa/indexes/hg19
Check this website if you have any questions:
http://seqanswers.com/wiki/How-to/exome_analysis
#s... 阅读全帖 |
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j*p
发帖数: 411 | 3 攒人品，顺便回答一下 iiiir 的问题。
我们尝试过好几种不同的SNP calling的方法，包括GATK, Samtools, Varscan,
SeqGenes, 等，并且做了SNP array 作为gold standard比较各种方法的prediction
power。
从我们的经验，BWA + GATK 最好，sensitivity 和 specificity 都在95%以上。
以下是GATK 的pipeline
假设你有一个control 样品C 和一个样本样品A的pair-end sequencing，共4个文件，C
_R1.fastq, C_R2.fastq, A_R1.fastq and A_R2.fastq如何通过BWA/GATK去找样品A中
的SNPs (相对于C)
假设assembly 用的是hg19，你的BWA index 在这里：/bwa/indexes/hg19
Check this website if you have any questions:
http://seqanswers.com/wiki/How-to/exome_analysis
#s... 阅读全帖 |
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h****n
发帖数: 333 | 4 同意，TALEN完全没必要用deep sequencing的方法确认indel，就普通的PCR条带直接
sanger测序然后分析足够了
序列分析用MutationSurveyor也可以看indel
deep sequencing不止是有钱任性，看indel还不如普通的sanger测序准确，何苦 |
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发帖数: 1 | 5 谢谢！我去看看。
不是，我的意思是一个样品测的RNAseq，0.5M reads里面，有indel的reads大概500（
甚至更低），另外的reads都可以map到基因组其他位置，但是没有indel，基本能100%
匹配。不知道说清楚没。
[在 googlealpha () 的大作中提到：]
:有个叫CRISPResso的工具也许对你有帮助：http://crispresso.rocks/
:但是，<0.1%, 这个已经在测序的误差范围内了。你怎么知道是gRNA造成的indel
？ |
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j******i
发帖数: 939 | 6 我的文章用的方法 请生物信息的人帮我分析的
The indel frequencies were analyzed using CRISPResso (Pinello, 2015) using
the CRISPRessoPooled amplicons mode, while ignoring substitutions.
Alternatively, and for further validation, the HiSeq reads were trimmed with
Sickle (Joshi and Fass, 2011), merged with FLASH (Magoč and Salzberg,
2011), and mapped to the amplicons using bowtie2 (Langmead and Salzberg,
2012). Reads with an average Phred score below 23 were discarded. The reads
were then aligned using EMBOSS wate... 阅读全帖 |
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c*******e
发帖数: 5818 | 7 有一个allele，我们做了TALEN，因为没有合适的限制性酶，用了T7, T7 indicate 可
能有“indel"，我的问题是，如何确认这个”indel"，不知直接deep sequence之类可
以不，不太想做PCR TA clone，然后做regular sequence。谢谢。 |
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c*******e
发帖数: 5818 | 8 先谢谢大家，我去研究研究你们的建议。
我的问题是PCR是mixture，估计也就<10%的 indel，所以要灵敏度高些的方法。
我现在想跑一个page gel，因为indel估计要induce size difference，这个要是行，
比较简单，直接对比WT。想过SSCP，但要麻烦些。 |
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h****n
发帖数: 333 | 9 啊，你是说你要看注射TALEN以后的第一代吗？那个确实没办法直接PCR测序，本来就是
各种indel的混合。我说的是outcross以后拿到单一allele以后的办法。
其实PCR以后TA cloning以后再sanger测序不难啊，也就顶多一个礼拜的工作量。
用HRMA的办法就可以不用测序了，省事很多。反正第一代本来就是mixture，无所
谓立刻知道到底有哪些indel。outcross以后拿到稳定单一hets再测序确定好了
你们实验室如果有能做HRMA的仪器也行,不差钱就买一台，不然到别的实验室蹭机子用
也成啊lol |
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h****n
发帖数: 333 | 10 你先看看能不能找到做HRMA的机器吧，不是一般实验室的常规配置
如果有的话，按说明书操作
对于多数没有这个机器的实验室，TA克隆了再测序没什么不好
最后，子一代因为是mixture，真心不用搞清楚到底是怎样的indel，只要用各种方法确
定确实有indel就可以了，具体的等outcross以后再测序确认 |
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发帖数: 1 | 11 If I'm not mistaken, you used CRISPR to introduce indels to a particular
target gene, followed by RNA-seq to measure the mRNA expression in genome-
scale including the target itself. You are worrying about the indels at the
target, as they will probably cause alignment problem in RNA-seq analysis.
Am I right? |
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j******i
发帖数: 939 | 12 t7是很可靠的。不放心的话可以把pcr条带做sanger测序，然后用tide分析. http://tide.nki.nl。tide是用来分析CRISPR的，不过调整一下参数也能看出有没有indel. 直接上deep sequencing的话, 我只能说有钱，任性！ |
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发帖数: 1 | 13 测序结果含有一小部分特殊的reads（<0.1%），是gRNA造成的indel的300bp长的测序
reads ［其余的reads都是正常的RNA测序reads］。请问怎么往reference genome上比
对，用什么方法？
谢谢！ |
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发帖数: 1 | 15 太对了！indel是在基因的3‘UTR区，所以不影响基因expression。
怎么比对？有成熟的发表的方法吗？
谢谢！
the |
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h**********r
发帖数: 671 | 16 以前大家讨论过，好像有个直接测indel产生比例的方法。不需要挑单个克隆，直接PCR
然后测序。找不到了。请大家帮助一下。多谢！ |
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g**********y
发帖数: 423 | 17 欢迎讨论，特别是各种程序的调用参数 。。。
http://dl.dropbox.com/u/62547840/NGS_Illumina.pm
http://dl.dropbox.com/u/62547840/NGS_Illumina.pl
screen output:
Illumina 1.3+ fastq format: ASCII(min, max) = (66, 102)
2012/08/25 11:41:15 START maq ill2sanger Run1_testicular-28T_lane2_read1_
sequence.txt Testis_T28_read1_sanger.fq
2012/08/25 11:42:57 SUCCESS after running 0 hours 1 minutes 42 seconds
2012/08/25 11:42:57 START maq ill2sanger Run1_testicular-28T_lane2_read2_
sequence.txt Testis_T28_read2_sanger.fq
2012/08/25... 阅读全帖 |
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j*p
发帖数: 411 | 18 本人在wet lab里面做纯数据分析，for NGS data analysis, 简单介绍一些自己接触过
，并且觉得挺有用的工具，说的有点杂，权作抛砖引玉，还请不吝赐教。
Next-Gen sequencing(NGS)和现在正在发展的3rd-gen sequencing将会在生物学研究中
被越来越广泛应用。不管你信不信，反正我信了。一是基于实验成本的降低（$1k
whole-genome sequencing is coming），越来越多的实验室可以操作；二是可以提供
相对low throughput experiment多的多的数据和信息，可以看到很多从前看不到的东
西；三是sequencer本身对测序的准确性正在逐渐提高，所以实验固有错误率降低；四
是各种算法的成熟应用，这使得很多由于实验产生的误差在出数据后通过对数据的分析
得以过滤。按照library preparation来分，NGS主要有DNA-seq和RNA-seq
DNA-seq is usually used as ChIP-seq to study transcription factor(TF)-DNA
bi... 阅读全帖 |
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j*p
发帖数: 411 | 19 本人在wet lab里面做纯数据分析，for NGS data analysis, 简单介绍一些自己接触过
，并且觉得挺有用的工具，说的有点杂，权作抛砖引玉，还请不吝赐教。
Next-Gen sequencing(NGS)和现在正在发展的3rd-gen sequencing将会在生物学研究中
被越来越广泛应用。不管你信不信，反正我信了。一是基于实验成本的降低（$1k
whole-genome sequencing is coming），越来越多的实验室可以操作；二是可以提供
相对low throughput experiment多的多的数据和信息，可以看到很多从前看不到的东
西；三是sequencer本身对测序的准确性正在逐渐提高，所以实验固有错误率降低；四
是各种算法的成熟应用，这使得很多由于实验产生的误差在出数据后通过对数据的分析
得以过滤。按照library preparation来分，NGS主要有DNA-seq和RNA-seq
DNA-seq is usually used as ChIP-seq to study transcription factor(TF)-DNA
bi... 阅读全帖 |
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u*********1
发帖数: 2518 | 20 楼主，对于CNV，simply forget it
貌似只有DGV是比较靠谱的NIH-sponsor的数据库，但我从来不会用，也不知道怎么用。
你别说CNV-phenotype了，就连CNV本身就没啥靠谱的数据库。
或者说的更明白点，以目前的sequencing技术条件和后期数据处理，CNV
identification和validation几乎不可信。主要是sequencing reads太短，而CNV（包
括copy number variation，del，dup，inv，translocation等等）根本无法通过这么
短的reads被identify。。。其实别说CNV了，就连2bp的indel都很困难，因为比如
intron-exon boundary有时候会有一连串的TTTTTT，那么你要确定到底是多了两个T，
还是少了两个T，是很困难的。
1000 genome project目前有indel和large deletion的database。1000G最后present出
来的indel/deletion我是比较相信的，但问题是他们present出来的只是genome里... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 21 For those who can not access the link
I copied the content here:
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
NgAgo
15 posts by 9 authors
Davide Seruggia
Jun 23
Hi,
I tried a couple of transfections with the NgAgo plasmid from Addgene and
the 5'P oligo against GFP from the paper, but I did not see a dramatic
reduction in GFP+ as seen using Cas9 and a GFP sgRNA.
Anybody tried as well and came to the same (dead) end?
Davide
k*****[email protected]
Jun 24
Hi, Davide,
I tried th... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 22 （CRISPR的背景资料请参阅Feng Zhang的“Genome engineering using the CRISPR-
Cas9 system”，Nature Protocols 8, 2281–2308 (2013)）
背景
我们是作一个与激素相关的肿瘤的。这个肿瘤的治疗方法已经相当完善，就是让身体里
不能生产激素或用一个小分子化合物抢占激素受体上激素的结合部位。但多年治疗后，
会有相当比例的病人产生抗药性。这个抗药性机理相当复杂。我们实验室一直致力于筛
选和现有药物不同的机理的小分子化合物，包括受体和DNA的结合或其他与受体相关的
pathway的inhibitors。前几年成功地筛选出了几个不同机理的化合物，个别在细胞水
平达到了nM的级别，动物测试也在10 mg/kg的水平。
最近在这个领域对抗药性肿瘤的研究发现，部分病人的抗药性是因为受体激素结合部位
发生了突变。一个或几个氨基酸的突变就能导致肿瘤细胞的生长不能被现有药物抑制。
所以，我们很想知道我们筛选出来的化合物对这些突变受体是不是也起作用。理论上来
说，我们的化合物不和激素竞争，突变不会影响我们化合物的效果。但只... 阅读全帖 |
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m****s
发帖数: 18160 | 23 2016年5月2日，英国《自然》杂志子刊《自然 生物技术》刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文，论文负责人的英文署名是"Chunyu Han"，这篇论文在华人生物界获得广泛赞誉。论文发表的第二天，韩春雨的名字和论文在一个名为"生物艺术全球生物医学交流"的微信群里得到了热烈讨论。生命体从受精卵开始，经过不断分裂，可分化出大约60兆亿个构建人类身体的细胞，每个细胞都含有全部生命遗传信息的基因组，所谓基因组编辑技术，就是人为来调整、改变、插入、去除、修改个体或物种的基因组序列。
http://tv.cctv.com/2017/05/20/VIDEBZRf7rQNg2Y1ExpBhpQM170520.shtml
一、学界和媒体的热议Mitbbs.com
一年前，英国《自然生物技术》杂志刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文。论文的负责人"一鸣惊人"，得到了学界和媒体给予的无限荣光。在《自然》杂志社的所属期刊上发表论文，通常表明，该科研成果走在了世界科学研究的最前沿，并有可能对未来科学的发展起到关键性作用。此消息一经媒体爆出，在站内引起站内相关专业人士的热议。
国内科研水平不得了了，河北科技大学在... 阅读全帖 |
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m****s
发帖数: 18160 | 24 2016年5月2日，英国《自然》杂志子刊《自然 生物技术》刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文，论文负责人的英文署名是"Chunyu Han"，这篇论文在华人生物界获得广泛赞誉。论文发表的第二天，韩春雨的名字和论文在一个名为"生物艺术全球生物医学交流"的微信群里得到了热烈讨论。生命体从受精卵开始，经过不断分裂，可分化出大约60兆亿个构建人类身体的细胞，每个细胞都含有全部生命遗传信息的基因组，所谓基因组编辑技术，就是人为来调整、改变、插入、去除、修改个体或物种的基因组序列。
http://tv.cctv.com/2017/05/20/VIDEBZRf7rQNg2Y1ExpBhpQM170520.shtml
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一年前，英国《自然生物技术》杂志刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文。论文的负责人"一鸣惊人"，得到了学界和媒体给予的无限荣光。在《自然》杂志社的所属期刊上发表论文，通常表明，该科研成果走在了世界科学研究的最前沿，并有可能对未来科学的发展起到关键性作用。此消息一经媒体爆出，在站内引起站内相关专业人士的热议。
国内科研水平不得了了，河北科技大学在... 阅读全帖 |
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c******n
发帖数: 16666 | 25 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: mitbbs (未名空间), 信区: Biology
标 题: Mitbbs水平挺高的，纯从科学家角度质疑韩春雨
发信站: BBS 未名空间站 (Sun May 21 23:40:17 2017, 美东)
2016年5月2日，英国《自然》杂志子刊《自然 生物技术》刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文，论文负责人的英文署名是"Chunyu Han"，这篇论文在华人生物界获得广泛赞誉。论文发表的第二天，韩春雨的名字和论文在一个名为"生物艺术全球生物医学交流"的微信群里得到了热烈讨论。生命体从受精卵开始，经过不断分裂，可分化出大约60兆亿个构建人类身体的细胞，每个细胞都含有全部生命遗传信息的基因组，所谓基因组编辑技术，就是人为来调整、改变、插入、去除、修改个体或物种的基因组序列。
http://tv.cctv.com/2017/05/20/VIDEBZRf7rQNg2Y1ExpBhpQM170520.shtml
一、学界和媒体的热议Mitbbs.com
一年前，英国《自然生物技术》杂志刊载了一篇有关"基因编辑工具"的... 阅读全帖 |
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u*********1
发帖数: 2518 | 26 作为一个曾经0基础的菜鸟，我还是蛮有体会的。
想想一年前我连linux里的grep都不晓得是啥。老板说“grep”，我说gre。。啥？greb
吗？老板摇摇头说you really have a lot to learn...不过老板超好，想办法给我把
各种基础的东西讲清楚。。。包括RAM是啥。。汗。。。
做NGS/bioinformatics的，我觉得核心思想还是：如何利用计算机手段解决生物问题。
说起来简单但未必每个人都深刻体会的到。什么python/bash/perl啥啥的，要入门很快
，但也绝对不是什么两个星期就搞定。我现在和python打交道也一年了，但也完全就是
个皮毛，主要是你自己的project决定的。。如果你永远只需要简单的process下你的
text，而且text如果不大比如100MB，你可以永远for line in text。。或者readlines
（），但如果碰到很大的text，就不能readlines（）了因为cluster可能没有那么大的
memory to load the whole text.
所以我觉得就是现学现用，除非你是CS系科班搞计算出身... 阅读全帖 |
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u*********1
发帖数: 2518 | 27 我觉得要考虑几个方面：
1.如何定义“遗传因素比较大”？ 想确定到底是familial还是sporadic，肯定要收集
足够的sample吧。。有时候对于有的疾病sample都很难收集。这不仅是人力，精力，
funding的问题，有的疾病病人死的很快，或者sample本身很少，总是很难碰到一个好
的大的pedigree的
2.NGS技术本身我当然是很看好的了，肯定越来越精确成熟，而且越来越便宜。但到底
能有多便宜？什么时候可以很轻松的给每个人做全基因组测序？read length可以达到
长?（肯定是越长越好）计算机的硬件能跟上NGS数据发展的趋势吗？
3.生物信息分析。我只能说现在的bioinformatic pipeline，除了read alignment和
SNP calling变的非常成熟（不仅sensitivity/specificity很高，而且可以做
population-level的分析），在其他方面，要么很艰难，要么很混乱。就是说无法达成
一个统一大家公认的最好的pipeline，我开发一个方法，你开发一个软件，最后把使用
者都搞的糊里糊涂的。比如indel cal... 阅读全帖 |
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r***e
发帖数: 2539 | 28 谁比较熟悉这个技术的能解释一下：
four weeks later,..... with 0.1% p53 indels and 0.4% LKB1 indels..... 0.1% K
rasG12D HDR events.
为什么KrasG12D HDR效率这么高，和p53 indel一样（而不是低几个量级），是不是表示
每个indel都发生了HDR？
谢谢！ |
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发帖数: 1 | 29 到目前为止，所谓的仇子龙看到了Indel，根本无法证明那个是NgAgo引起的，有常识的
做过测序的人都知道，即使你拿同一个样品去测一百遍，你肯定会在其中的少许几个测
序结果中发现会有所谓的indel，这种indel不是真实的indel，而只是测序本身带有的
误差（这个是很正常的，喷子喷之前请先做功课）。要想证明NgAgo具有基因组层面的
编辑功能，请参照CRISPR-Cas9的检测标准。
搞了这么久，韩春雨所谓的全国20个实验室重复出来，原来是这种重复结果，真的令人
觉得可笑。现在应该是时候给杂志社写comment了 |
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发帖数: 1 | 30 到目前为止，所谓的仇子龙看到了Indel，根本无法证明那个是NgAgo引起的，有常识的
做过测序的人都知道，即使你拿同一个样品去测一百遍，你肯定会在其中的少许几个测
序结果中发现会有所谓的indel，这种indel不是真实的indel，而只是测序本身带有的
误差（这个是很正常的，喷子喷之前请先做功课）。要想证明NgAgo具有基因组层面的
编辑功能，请参照CRISPR-Cas9的检测标准。
搞了这么久，韩春雨所谓的全国20个实验室重复出来，原来是这种重复结果，真的令人
觉得可笑。现在应该是时候给杂志社写comment了 |
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发帖数: 1 | 31 The key question here is if the NgAGO is working really vs. Artificially
observed several indels.
If the indel is real, that is, the indel is as expected from experimental
design, even, the frequency is low, then NgAGO is working, then there is no
need to discuss the repetition of the NBT paper. All the remaining work is
to improve its efficiency.
Alternatively, if those indels were just randomly generated, not expected
from experimental designs, then, NgAGO has not worked in their experiments.
... 阅读全帖 |
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m****s
发帖数: 18160 | 32 2016年5月2日，英国《自然》杂志子刊《自然 生物技术》刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文，论文负责人的英文署名是"Chunyu Han"，这篇论文在华人生物界获得广泛赞誉。论文发表的第二天，韩春雨的名字和论文在一个名为"生物艺术全球生物医学交流"的微信群里得到了热烈讨论。生命体从受精卵开始，经过不断分裂，可分化出大约60兆亿个构建人类身体的细胞，每个细胞都含有全部生命遗传信息的基因组，所谓基因组编辑技术，就是人为来调整、改变、插入、去除、修改个体或物种的基因组序列。
http://tv.cctv.com/2017/05/20/VIDEBZRf7rQNg2Y1ExpBhpQM170520.shtml
一、学界和媒体的热议Mitbbs.com
一年前，英国《自然生物技术》杂志刊载了一篇有关"基因编辑工具"的论文。论文的负责人"一鸣惊人"，得到了学界和媒体给予的无限荣光。在《自然》杂志社的所属期刊上发表论文，通常表明，该科研成果走在了世界科学研究的最前沿，并有可能对未来科学的发展起到关键性作用。此消息一经媒体爆出，在站内引起站内相关专业人士的热议。
国内科研水平不得了了... 阅读全帖 |
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t*******w
发帖数: 107 | 33 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28557981/#comments
FYI all.
Xiaolin Wu2017 May 31 2:11 p.m. (6 days ago) 9 of 9 people found this
helpful
This paper raises important safety issue for gene therapy application of
CRISPR-Cas9. However, there are serious doubts about the results or
interpretation. First of all, the authors listed Top-10 predicted off-target
sites. But all genes are wrong! looking at the sequence they listed (supp.
figure 3), you will not be able to find it in the genes! After ca... 阅读全帖 |
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n******7
发帖数: 12463 | 34 情况大概是这样：我们做了很多cDNA clone，测序之后选取了一些进行了下游的实验，
主要是in vitro 的protein实验。我们鉴定了很多新的splicing isoform，其中有不少
有premature stop codon(可以是splicing 造成的，也可以使indel造成的）
现在我们想做一些quality control，去掉一些不靠谱的transcripts，于是出现了分歧
组里的大姐想法是要尽量跟已知的protein一致。把每条isoform对应的protein align
到已有的protein sequence上。如果整条protein基本align上去，即便使truncated
protein, 不管什么原因，都可以作为partial protein 保留。但是如果shifted frame
的amino acid sequence长到一定程度，那就认为这些protein sequence跟已有的
sequence太不一样，要除去
我完全明白大姐为什么那么想，因为我们实际test的是一些protein sequences
但是就我这部分工作，我需要关... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 35 Plus
To LZ:
just check,
>http://bcbio.wordpress.com/tag/ngs/
cited:
>Access VCF variant information
>In addition to extending the GATK through walkers and annotations you can
also utilize the extensive API directly, taking advantage of parsers and
data structures to handle common file formats. Using Clojure’s Java
interoperability, the variantcontext module provides a high level API to
parse and extract information from VCF files. To loop through a VCF file and
print the location, reference alle... 阅读全帖 |
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z*t
发帖数: 863 | 36 我们用32D细胞做indel，电转，addgene上的P458/459都试过。
电转效率比较低，2-3% GFP+,筛出single cell colony,里面8~9/10都有indel，不过
indel是相当heterogenous,几乎没有一样的。
puro因为电转效率太低，没有长起来。 |
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发帖数: 1 | 37 听说韩春雨现在也在重复自己的实验，成百成百地送克隆出去测序。我想说的是，即使
看到一两个indel，也是不算数的。
我知道国内也有一两家实验室测几十上百个克隆的序，也是能看到indel的。
但是如果对不加任何处理的细胞测几十上百个克隆，我猜也是有可能看到一两个indel
的，这是实验本身的系统误差、背景噪声。所以实验组测的样本数量，对照组也得相应
有足够，而且要有充分的对照（不加NgAgo只加gDNA，以及什么都不加）。不然统计显
著性就过不去。
所以测序也不是标准，统计才是。 |
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j******i
发帖数: 939 | 38 测序的结果跟T7EI要一起看才完整 两者最后的indel百分比应该是接近的 你咋知道他
成百成百的送啊 他文章里indel都是20-40% 意味这测几十个克隆就能看到好几个indel了 |
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发帖数: 1 | 39 我来说说ngAgo的局限：
1.ngAGO是否真如文章所述，不和ssRNA结合。我觉得需要通过通过高通量测序进行验证
，电泳胶的灵敏度太低，看不到不代表没有。
2.ngAgo是否和内源ssDNA或ssRNA结合，如果它的结构和TtAgo类似（包含PIWI，PDZ以
及MID domain），那么这些保守的domain也存在于与ngAgo同源的argonautes（Ago2）
中，需要利用灵敏度比较高的手段才能说明这个问题，保不齐ngAgo会对PIWI或RNAi通
路有影响，5‘p-ssDNA以及5’p-ssRNA在细胞中存在，尤其是在germ cell的分化过程
中以及很多种类的癌细胞中，如果ngAgo和它们结合的话，这将大大限制其在此类细胞
中的应用。
3. ssDNA loading 的问题，目前对于ssDNA load到Argonaute形成DNP的机制尚不清楚
，在细胞内ssDNA load到Argonaute是不是需要其他蛋白质（比如伴侣蛋白，热激蛋白
等）的辅助，甚至Argonaute折叠成functional protein是否需要ssDNA的帮助，这些都
不是很清楚。
... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 40 第一类“重复” 验证实验信息：匿名或无记名，网络、论坛发布
-成功重复、拓展验证韩春雨NgAgo实验
-包含无任何实验细节描述，无发布方城市，国家等细节的信息发布
-不包含以韩春雨名义单方发布的信息
- 发布方：未知
- 发布时间：2016年8月4日
- 发布平台：google Pooran's NgAgo Survey
- 发布方国家：未知
- 发布方城市：未知
- 发布方研究机构：未知
- 实验室PI：未知
- NgAgo的来源：未知
- 重复验证实验结果: 成功重复、拓展验证韩春雨NgAgo实验
- 重复验证实验详细信息：未知 - Survey 选项：NgAgo works，observed indel
and epitope tag knock-in
- 实验数据发表状态：无
- 实验数据发表的科研杂志：无
注：
- 2016年8月4日，Addgene blog发布的数据显示， 在blog发布前
-- 165 researchers 参与了google Pooran's NgAgo Survey
-- 88... 阅读全帖 |
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c********n
发帖数: 225 | 41 第一类“重复” 验证实验信息：匿名或无记名，网络、论坛发布
-成功重复、拓展验证韩春雨NgAgo实验
-包含无任何实验细节描述，无发布方城市，国家等细节的信息发布
-不包含以韩春雨名义单方发布的信息
- 发布方：未知
- 发布时间：2016年8月4日
- 发布平台：google Pooran's NgAgo Survey
- 发布方国家：未知
- 发布方城市：未知
- 发布方研究机构：未知
- 实验室PI：未知
- NgAgo的来源：未知
- 重复验证实验结果: 成功重复、拓展验证韩春雨NgAgo实验
- 重复验证实验详细信息：未知 - Survey 选项：NgAgo works，observed indel
and epitope tag knock-in
- 实验数据发表状态：无
- 实验数据发表的科研杂志：无
注：
- 2016年8月4日，Addgene blog发布的数据显示， 在blog发布前
-- 165 researchers 参与了google Pooran's NgAgo Survey
-- 88... 阅读全帖 |
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发帖数: 1 | 43 以下这段描述的匿名生物学家应该是仇子龙, 部分回答了仇为什么后来不发言了：
八
国内一位要求匿名的生物学家今年6月开始尝试利用NgAgo编辑几种哺乳动物细胞系基因
组中的基因。
在经历过几个细胞系上的失败后，“我们观察到针对绿色荧光GFP基因的NgAgo处理的人
iPS细胞（基因组内有预先嵌入的绿色荧光GFP基因）有一些细胞绿色荧光降下来了。这
个结果不奇怪，因为很多组发现Ngago系统有敲低现象，而没有基因组编辑”。
经过深度测序，他发现Indels有存在，但是效率比Cas9低数倍，“而且发生的位置也很
奇特”。 “第一，同组相应位点有Cas9的正对照，而且负对照组没有Indel出现，虽然
可能性不大但是从科学严谨的角度，我们仍然担心可能存在Cas9系统污染到Ngago组的
情况；第二，我们也担心我们当时的生物信息学的分析方法不够好，原因是我们第一轮
扩增的时候，没有用带Barcode(单分子标签，指一种在测序文库建立过程中加入的DNA
序列，用于在后续分析中唯一确定测序模板的来源)的引物，所以我们不能确定每个拷
贝携带Indel的序列从哪里来”。
10月10日，这位科学家告诉《知识... 阅读全帖 |
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h****n
发帖数: 333 | 44 next generation sequencing和array看的东西不一样，目前的技术水平还无法互相替
代。前者看SNV和小的indel，后者看CNV
对于大片段缺失，high resolution array是目前最精确的办法。next generation
sequencing，不管是targeted还是exome，目前的算法都没办法准确看到大片段缺失的
。目前的几个从exome sequencing data看大片段缺失的算法，比如Conifer之类，都达
不到诊断精度的，也就在research lab里用着玩玩。nextgen主要看的是SNV，顶多小的
indel（就算小的indel目前的calling algorithm也不算太准，相比SNV而言）。
对于lz那个7q32，如果目前只有karyotyping结果，那确实不够准，array能找到更准确
的缺失位置。那个abstract里的7q32q34已经做过array了，精度不是问题了，反正
目前也没有更精准的办法了，再做nextgen也没用的。关键问题还是这个区域到底是不
是pathogenic的。我没有看到完整的pap... 阅读全帖 |
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t*d
发帖数: 1290 | 45 MONTREAL (GenomeWeb News) – Analyses of data for nearly 1,100 individuals
assessed through phase 1 of the 1000 Genomes Project have uncovered more
than 40 million genetic variants in the human genome, including almost 30
million SNPs not detected previously.
Overall, the researchers identified some 37.9 million SNPs in the dataset,
including 29.7 million new SNPs. In addition, the team tracked down 3.8
million short indels and 14,000 large deletions. McVean noted that this set
represents highly ... 阅读全帖 |
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b****r
发帖数: 17995 | 46 谢谢
你读得比我更仔细,那个unzip double strand 的步骤确实没看到。
至于最后要多少个coverage，我没有算，你的描述里也没说出来，还是难以作出结论，
也许nanopore的coverage可以做到很高，这个还得花时间仔细算算。不过我觉得这个是
很难蒙混过关的，只要nanopore把数据拿出来，中学生也能算到很清楚，到底最后
coverage 多高，每个碱基精确性多高
你说的PCR even out error，我不太同意。你看看这个图
http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n12/fig_tab/nmeth.1270_F
如果我没搞错，illumina现在仍然是基于这个原理，我理解的PCR是左下最后一个蓝框
，不是右第三个黄框。前面这个amplification仍然是error prone的，特别是对于染色
体的很多区段，可能扩增效率很低，而且还有pcr的error问题和allelic dropoff的问
题（这些缺陷nanopore都应该没有）。实际上你去看illunima 的raw data，错误还是
相当多的，不是你... 阅读全帖 |
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z*t
发帖数: 863 | 47 我印象中David Allis group用GFP tag过H3.3。是不是indel的关系？
Caspir的indel在feng zhang那篇paper看起来还是挺明显的。 |
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z*t
发帖数: 863 | 48 我印象中David Allis group用GFP tag过H3.3。是不是indel的关系？
Caspir的indel在feng zhang那篇paper看起来还是挺明显的。 |
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f********e
发帖数: 15 | 49 最近在做CRISPR突变，得到一些indel mutation。因为是hetrozygous， 所以不做TOPO
cloning就看不出每一个allele的序列是什么。
记得以前有人曾经提到过用一个软件可以直接分析heterozygous的indel mutation序列
，只是现在记不得了，不知有人知道有什么样的免费软件可以进行这方面的分析？另外
，这样的准确度有多高？是不是就不用TOPO cloning了？ 多谢指教！ |
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c*********r
发帖数: 1312 | 50 这个问题我也很感兴趣，期待版上高人回答。
我的理解，人跟人之间的基因组的差异还是有一些，尤其是病人的话，大家肯定想找出
差异。如果简单的把序列map到reference genome上边，有些差异比如SNP，小的indel
还是可以找得到，但是很多复杂的差异，大片段的indel、invertion什么的，也许就不
太容易找到了。
这里有篇很好的2015年的nature review：Genetic variation and the de novo
assembly of human genomes
“Short-read massively parallel sequencing has revolutionized our ability to
discover genetic variation but is insufficient to generate high-quality
genome assemblies or resolve most structural variation. Full resolution of
variation is only guaran... 阅读全帖 |
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