f*****f 发帖数: 195 | 1 我希望将一个內源蛋白加个tag。
1)假如knockin的话,直接在genomic sequence加tag本身会不会导致alternative
splicing?表达就全乱了。小tag也许没问题,大tag如gfp就基本不行吧。
2)那一般knockin是把外源promoter+cDNA+tag一起knock-in么?这样的话蛋白表达量
可能跟内源有可能差很远?
3)针对2),knockin 到染色体具体哪个区域有讲究么?转基因就随机插入了。
谢谢。 |
s********r 发帖数: 312 | 2 一般是在你目的基因下游紧挨着放ires-gfp,加tag的话就不用ires |
f*****f 发帖数: 195 | 3 谢谢。有个疑问,直接放ires-gfp或gfp,基因组序列一下增加了几百bp,不会导致可
变剪切吗?
【在 s********r 的大作中提到】 : 一般是在你目的基因下游紧挨着放ires-gfp,加tag的话就不用ires
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l********e 发帖数: 415 | 4 如果你放splicing acceptor site的话,的确会 ...
【在 f*****f 的大作中提到】 : 谢谢。有个疑问,直接放ires-gfp或gfp,基因组序列一下增加了几百bp,不会导致可 : 变剪切吗?
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r***z 发帖数: 19 | 5 这个IRES-EGFP是加在最后一个外显子的终止密码子后面吧,last exon -ires-eGFP-
ployA. |
l***y 发帖数: 638 | 6 用2A吧,效率会比ires高,需要detele掉gene本来的stop codon【 在 rexhz (
rexhuang) 的大作中提到: 】 |
r***z 发帖数: 19 | 7 如果我只是想加个 gfp 便于我观察这个基因是否表达,这样做行不行。 promoter ---
--- ATG+eGFP+first exon----
【在 r***z 的大作中提到】 : 这个IRES-EGFP是加在最后一个外显子的终止密码子后面吧,last exon -ires-eGFP- : ployA.
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w*****r 发帖数: 2061 | 8 1)老鼠出来肯定得validate一下,Western看看,不用定位的话用2A-GFP试试?
2)这种一般叫transgenic吧,不叫knockin
【在 f*****f 的大作中提到】 : 我希望将一个內源蛋白加个tag。 : 1)假如knockin的话,直接在genomic sequence加tag本身会不会导致alternative : splicing?表达就全乱了。小tag也许没问题,大tag如gfp就基本不行吧。 : 2)那一般knockin是把外源promoter+cDNA+tag一起knock-in么?这样的话蛋白表达量 : 可能跟内源有可能差很远? : 3)针对2),knockin 到染色体具体哪个区域有讲究么?转基因就随机插入了。 : 谢谢。
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f*****f 发帖数: 195 | 9 谢谢。假如我希望表达fusion protein,不是用2A-GFP或ires,比如如上所面帖子,
ATG-GFP-exon1-...即把gfp插入到第一个exon之前可行么?另外,可以把GFP序列插入
到最后一个exon之后。在体外瞬时转染,gfp放在N或C端有时会影响蛋白自身,一般做
knockin的话,该如何选择?为规避这种,还是knockin一般用小tag的多?比如flag,
v5等等。
【在 w*****r 的大作中提到】 : 1)老鼠出来肯定得validate一下,Western看看,不用定位的话用2A-GFP试试? : 2)这种一般叫transgenic吧,不叫knockin
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s********x 发帖数: 472 | 10 插gfp当然没问题,这个我们领域做的多了。
可变剪切从来没听说过,就算有也很少。
需要注意的事gfp会不会影响蛋白功能。 |
s********x 发帖数: 472 | 11 关键还是你的knockin可以完全替代endogenous/wt gene。
这是gold rule |
f*****f 发帖数: 195 | 12 谢谢。
【在 s********x 的大作中提到】 : 关键还是你的knockin可以完全替代endogenous/wt gene。 : 这是gold rule
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