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Biology版 - 问knockin或转基因
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IRES和GFP中间放点序列,应该不影响吧低表达量蛋白的western请教
请教高手们一个knockin的问题,用cDNA和fulllength genomic DNA 有那些考究问个基因表达选promoter的问题
问个关于RLM 5'RACE的问题请教OVEREXPRESSION 蛋白保证不移码的问题? 谢谢
请教做knockin老鼠,用EGFP标记好还是luciferase好?有用pll3.7包装病毒做蛋白表达的吗?
把IRES knock in到内源基因位点会抑制上游基因表达么?请问双荧光reporter老鼠的问题
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相关话题的讨论汇总
话题: knockin话题: gfp话题: tag话题: ires话题: 转基因
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f*****f
发帖数: 195
1
我希望将一个內源蛋白加个tag。
1)假如knockin的话,直接在genomic sequence加tag本身会不会导致alternative
splicing?表达就全乱了。小tag也许没问题,大tag如gfp就基本不行吧。
2)那一般knockin是把外源promoter+cDNA+tag一起knock-in么?这样的话蛋白表达量
可能跟内源有可能差很远?
3)针对2),knockin 到染色体具体哪个区域有讲究么?转基因就随机插入了。
谢谢。
s********r
发帖数: 312
2
一般是在你目的基因下游紧挨着放ires-gfp,加tag的话就不用ires
f*****f
发帖数: 195
3
谢谢。有个疑问,直接放ires-gfp或gfp,基因组序列一下增加了几百bp,不会导致可
变剪切吗?

【在 s********r 的大作中提到】
: 一般是在你目的基因下游紧挨着放ires-gfp,加tag的话就不用ires
l********e
发帖数: 415
4
如果你放splicing acceptor site的话,的确会 ...

【在 f*****f 的大作中提到】
: 谢谢。有个疑问,直接放ires-gfp或gfp,基因组序列一下增加了几百bp,不会导致可
: 变剪切吗?

r***z
发帖数: 19
5
这个IRES-EGFP是加在最后一个外显子的终止密码子后面吧,last exon -ires-eGFP-
ployA.
l***y
发帖数: 638
6
用2A吧,效率会比ires高,需要detele掉gene本来的stop codon【 在 rexhz (
rexhuang) 的大作中提到: 】
r***z
发帖数: 19
7
如果我只是想加个 gfp 便于我观察这个基因是否表达,这样做行不行。 promoter ---
--- ATG+eGFP+first exon----

【在 r***z 的大作中提到】
: 这个IRES-EGFP是加在最后一个外显子的终止密码子后面吧,last exon -ires-eGFP-
: ployA.

w*****r
发帖数: 2061
8
1)老鼠出来肯定得validate一下,Western看看,不用定位的话用2A-GFP试试?
2)这种一般叫transgenic吧,不叫knockin

【在 f*****f 的大作中提到】
: 我希望将一个內源蛋白加个tag。
: 1)假如knockin的话,直接在genomic sequence加tag本身会不会导致alternative
: splicing?表达就全乱了。小tag也许没问题,大tag如gfp就基本不行吧。
: 2)那一般knockin是把外源promoter+cDNA+tag一起knock-in么?这样的话蛋白表达量
: 可能跟内源有可能差很远?
: 3)针对2),knockin 到染色体具体哪个区域有讲究么?转基因就随机插入了。
: 谢谢。

f*****f
发帖数: 195
9
谢谢。假如我希望表达fusion protein,不是用2A-GFP或ires,比如如上所面帖子,
ATG-GFP-exon1-...即把gfp插入到第一个exon之前可行么?另外,可以把GFP序列插入
到最后一个exon之后。在体外瞬时转染,gfp放在N或C端有时会影响蛋白自身,一般做
knockin的话,该如何选择?为规避这种,还是knockin一般用小tag的多?比如flag,
v5等等。

【在 w*****r 的大作中提到】
: 1)老鼠出来肯定得validate一下,Western看看,不用定位的话用2A-GFP试试?
: 2)这种一般叫transgenic吧,不叫knockin

s********x
发帖数: 472
10
插gfp当然没问题,这个我们领域做的多了。
可变剪切从来没听说过,就算有也很少。
需要注意的事gfp会不会影响蛋白功能。
s********x
发帖数: 472
11
关键还是你的knockin可以完全替代endogenous/wt gene。
这是gold rule
f*****f
发帖数: 195
12
谢谢。

【在 s********x 的大作中提到】
: 关键还是你的knockin可以完全替代endogenous/wt gene。
: 这是gold rule

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