f****o
发帖数: 2770 | 1 去年录得，天籁k歌，效果也一般，录得还是Avril的版本
看到符合活动就贴上来了嘻嘻
http://app.box.com/s/915912otg3pbpkyujw86
"Knockin' On Heaven's Door"
Mama, take this badge off of me
I can't use it anymore.
It's gettin' dark, too dark to see
I feel I'm knockin' on heaven's door.
Knock, knock, knockin' on heaven's door X 4
Mama, put my guns in the ground
I can't shoot them anymore.
That long black cloud is comin' down
I feel I'm knockin' on heaven's door.
Knock, knock, knockin' on heaven's door X 4 |
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f*****f
发帖数: 195 | 2 我希望将一个內源蛋白加个tag。
1）假如knockin的话，直接在genomic sequence加tag本身会不会导致alternative
splicing?表达就全乱了。小tag也许没问题，大tag如gfp就基本不行吧。
2）那一般knockin是把外源promoter+cDNA+tag一起knock-in么？这样的话蛋白表达量
可能跟内源有可能差很远？
3）针对2），knockin 到染色体具体哪个区域有讲究么？转基因就随机插入了。
谢谢。 |
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f*****f
发帖数: 195 | 3 谢谢。假如我希望表达fusion protein，不是用2A-GFP或ires，比如如上所面帖子，
ATG-GFP-exon1-...即把gfp插入到第一个exon之前可行么？另外，可以把GFP序列插入
到最后一个exon之后。在体外瞬时转染，gfp放在N或C端有时会影响蛋白自身，一般做
knockin的话，该如何选择？为规避这种，还是knockin一般用小tag的多？比如flag，
v5等等。 |
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l*****g
发帖数: 43 | 4 想用knockin表达一个基因（不同种系），为什么有些人用genomic DNA（intron和exon
），而不是简单的full length cDNA？我不需要高表达，只要right amount， right
place。 |
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r**z
发帖数: 37 | 5 knockin还真没见过有人用gDNA的，能给个例子吗？谢谢
exon |
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o**4
发帖数: 35028 | 6 方法这么多啊，晕了，
这个能做knockin吗？ |
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f**u
发帖数: 346 | 7 你确定有人做了knockin吗？修改几个base pair的不算。
这些文章我就算没全看也看了大部分，没记得有楼主问的那种KI。
Science |
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l**********1
发帖数: 5204 | 8 RE:
adeno (天夺其魄) 的post:
不是吧,
Jennifer A. Doudna HHMI
UC Berkeley组 &瑞典于默奥大的 Charpentier组的 manuscript 被 Sci magazine
accepted for publication
2012 summer n天后的
conference 上 Emma Charpentier (she) will like to note it, isn't it?
Feng Zhang 的2013 Sci magazine paper adeno (天夺其魄) 您看了全文后
看了全部references 它们的whole abstract parts 了吗?
pls refer
Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems
Science. (2013) 339: 819-23.
by
Le Cong F. et al. and Feng Zhang
web link:
>HTTP://www.ncbi.nlm.nih... 阅读全帖 |
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o**4
发帖数: 35028 | 9 方法这么多啊，晕了，
这个能做knockin吗？ |
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f**u
发帖数: 346 | 10 你确定有人做了knockin吗？修改几个base pair的不算。
这些文章我就算没全看也看了大部分，没记得有楼主问的那种KI。
Science |
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l**********1
发帖数: 5204 | 11 RE:
adeno (天夺其魄) 的post:
不是吧,
Jennifer A. Doudna HHMI
UC Berkeley组 &瑞典于默奥大的 Charpentier组的 manuscript 被 Sci magazine
accepted for publication
2012 summer n天后的
conference 上 Emma Charpentier (she) will like to note it, isn't it?
Feng Zhang 的2013 Sci magazine paper adeno (天夺其魄) 您看了全文后
看了全部references 它们的whole abstract parts 了吗?
pls refer
Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems
Science. (2013) 339: 819-23.
by
Le Cong F. et al. and Feng Zhang
web link:
>HTTP://www.ncbi.nlm.nih... 阅读全帖 |
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o**4
发帖数: 35028 | 12 crispr这个东西，能用来做knockin插入1-200bp的片段到基因组吗？
zfn |
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o**4
发帖数: 35028 | 13 能做knockin插入1-200bp到基因组吗？ |
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w*e
发帖数: 740 | 17 能先解释一下 什么是promoter knockin mice? |
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z*******6
发帖数: 679 | 18 OK... sorry about my confusion...
应该说替换promoter... 应该属于study regulatory element... 我的老鼠是把人的基
因的promoter region，1.5 kb左右knockin到老鼠的promoter的地方... 然后看有没有
什么生理病理意义...
我昨天我们这新来的PI聊了会天，他给我了片关于Hox gene的cell paper，也是study
regulatory element，看着貌似挺好玩的... |
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z*******6
发帖数: 679 | 19 嗯，我们两个老鼠都有，transgene的老鼠paper已经发了，还剩个knockin没发，所以
我就需要characterize一下，找几个model test一下就ok了... |
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z*******6
发帖数: 679 | 20 对呀，爽也不爽，不过我觉得对我来说挺好的，算是别人给我的老鼠，作为graduate
student的side project还是很好的，老板说让我就简单做做，没有什么特殊的model或
者phenotype搞片JBC就行了，我也无所谓了，因为貌似却是没有什么技术含量... 就是
基本上重复之前transgenic的实验...
所以我就上来问问大家这种knockin有木有神马新意... 看能从JBC提高到blood不... |
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w***r
发帖数: 709 | 21 Promoter 可以换成 synthetic non coding DNA Knockin，比较sexy,直奔西嗯爱死 |
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z*******6
发帖数: 679 | 22 您抬举我了啊... 三年级PhD在读一枚...
我们实验室做endothelial cell adhesion molecule，具体什么就不说了... 主要不是
怕被scoop，因为就我们老板对这个感兴趣，但就是不太想自爆实验室而已...
简单介绍一下背景...
这个分子人跟老鼠的调控不一样，目前发现人的分子promoter区域木有canonical NF-
kB binding site，所以不被TNF-a之流上调（甚至下调一倍左右的样子），而老鼠的有
canonical NF-kB binding site，所以会被TNF-a之流上调（上调几十倍的样子）...
in vitro和baboon model都证明了，加上我们的bac transgenic老鼠，也都一直是
consistent的结果...
然后体外结果证明这1.5kb左右的promoter对这种inducible expression的区别很重要.
.. 所以这个knockin老鼠就要用来看看是不是体内也是一样的，同时我计划找几个简单
的pathophysiological或者bacterial infection m... 阅读全帖 |
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z*******6
发帖数: 679 | 23 bac和knockin老鼠都有了... 我属于后人乘凉的... 前人栽树的时候我还没来呢...
phenotype也基本跟预测的一样，现在就需要好的model搞一搞...
大. |
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w********a
发帖数: 324 | 24 在bacteria中，想knockin一个外来基因到chromsome中的话，最好插入到什么地方呢？
1. silent gene（通过transcriptional analysis确认的genome中没有表达的基因）；
2. Some intergenic region
3. 某tRNA 基因 rigion
谢谢！ |
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s****9
发帖数: 932 | 25 大家有没有推荐的好的做knockin的公司，C57BL/6上的？
最好能给个价格，我好参考一下。 |
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w*****r
发帖数: 2061 | 26 1)老鼠出来肯定得validate一下，Western看看，不用定位的话用2A-GFP试试？
2)这种一般叫transgenic吧，不叫knockin |
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s********x
发帖数: 472 | 27 关键还是你的knockin可以完全替代endogenous/wt gene。
这是gold rule |
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f******g
发帖数: 1003 | 28 想做个transgenic小鼠(over-express one gene in a mouse)，感觉可能会致死，所以
想做inducible knockin mouse。
请问哪位知道些具体的，能说说吗?
谢谢 |
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m*p
发帖数: 226 | 29 有商业化的用CRISPR 或者 TALEN 来做knockin 吗？请给个链接或电话。 谢谢！ |
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m*p
发帖数: 226 | 30 "DIY"是什么啊？
我也可以用传统的方法做knockin， 但是花费大概2万8千。用传统方法但是更便宜的公
司也可以考虑。 谁有相关的信息吗？谢谢！ |
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m*p
发帖数: 226 | 31 It is not as easy as you said. You need to do super ovulation ,
microinjection, and put the embryos to pseudo pregnant female via surgery,
etc.. 若是成批的生产老鼠可以考虑，就造几只老鼠，不值得。
还是要问，谁有相关的knockin 公司的信息吗？ 谢谢先！ |
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k********n
发帖数: 756 | 32 I am planning to create virtue diseases by CRISPR knockin mutationS in human
iPSC lines.Anybody can give some references and thoughts? |
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s**2
发帖数: 1287 | 33 很久以前看到有人在版上说做 CRISPR knockin 用单链 RNA 作为模板。
想找来看看，死活找不到了。
麻烦高手指教。谢谢！ |
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D****g
发帖数: 275 | 34 要在老鼠的某个gene中knockin 一个突变，正在考虑怎么做，大家有好的公司推荐吗？
谢谢！ |
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t******n
发帖数: 2939 | 35 ☆─────────────────────────────────────☆
yunyunluo (云萝) 于 (Sun Sep 22 22:11:11 2013, 美东) 提到:
因为王菲离婚的事，我突然想八一八窦唯的现状，不过报道太少了，也只能瞎掰两句
看娱乐新闻，很难看到窦唯的八卦了，之前有人捕风捉影说他谈了个新的小女友，两人
骑自行车出游，猜测窦唯现在财产状况不好
窦唯状况好不好，还真说不清楚，从一些他的活动来看，确实是，从和王菲离婚后一直
在走下坡路，04年以后基本上没有出专辑了，也没有什么新歌出来，更多的是往电影音
乐方面走，偶尔还去酒吧驻唱，生活应该还不至于像一些八卦杂志说的那么穷困潦倒，
不过对于一个曾经红极一时的人来说，确实算是彻底的淡出人们视线，没落了。这窦唯
除了骂脏话发发脾气也没见报道有什么不良嗜好，即使没落了，还不至于没钱花没地方
住吃不饱饭。
说来，我觉得窦唯这人渣得挺无语的，应该说是太笨了，分不清什么是感情什么是责任
什么是生活，先是和姜昕谈恋爱，这段算是最纯最简单的爱恋了，感情在就在一起，感
情没了就分开，算是他所有感情里面最干脆的了，没有什... 阅读全帖 |
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w*********p
发帖数: 3305 | 36 专辑21 《Use Your Illusion I & II》 中文 《运用你的幻想I & II》 – Guns N’
Roses（枪炮与玫瑰）
Use Your Illusion I
1. "Right Next Door to Hell"
2. "Dust N' Bones"
3. "Live and Let Die" (Paul McCartney & Wings cover)
4. "Don't Cry" (original version)
5. "Perfect Crime"
6. "You Ain't the First"
7. "Bad Obsession"
8. "Back Off Bitch"
9. "Double Talkin' Jive"
10. "November Rain"
11. "The Garden" (featuring Alice Cooper and Shannon Hoon)
12. "Gar... 阅读全帖 |
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m*****0
发帖数: 4 | 37 RollingStone The 500 Greatest Songs of All Time
《滚石》杂志评史上最伟大的500歌曲
NO.001～NO.025
001 - Bob Dylan - Like A Rolling Stone (1965)
002 - The Rolling Stones - Satisfaction (1965)
003 - John Lennon - Imagine (1971)
004 - Marvin Gaye - What's Going On (1971)
005 - Aretha Franklin - Respect (1967)
006 - The Beach Boys - Good Vibrations (1966)
007 - Chuck Berry - Johnny B. Goode (1958)
008 - The Beatles - Hey Jude (1968)
009 - Nirvana - Smells Like Teen Spirit (1991)
010 - Ray Charles - What'd I Say (195... 阅读全帖 |
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h*d
发帖数: 19309 | 38 我到家都快3点了。转一个review. (其中一个SB吉他也带一个bucket hat，某个Bass还
唱了一首...)
Concert review: Up late with Guns N' Roses
Article by: Star Tribune
Updated: November 14, 2011 - 11:01 AM
Axl Rose had his voice, and his remade band had the old-school muster in a
show that ended at 2 a.m.
Only at a Guns N' Roses concert circa 2011 does an 11:15 p.m. start time
qualify as early. Only at a GNR concert does the singer get kudos for acting
like he's happy to be there. And only the modern GNR can fatten up a show... 阅读全帖 |
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l*s
发帖数: 6372 | 39 模仿没什么吧，比如说 Avril Lavigne 也模仿了好多歌，Knockin' on Heaven's Door
之类的，还有好多其他西方歌手也翻唱了这首歌，YOUTUBE评论说Avril懂得选择歌。再
说很多翻唱也能翻的比原曲好听，true color的Christophe willem版本就比原版好听
，相较于原版的Knockin' on Heaven's Door，我还是比较喜欢Avril版本的。当然也有
演绎差的，比如说Sarah Brightman演绎的Scarborough Fair就是失败，失去了原作的
淡然宁静。王菲的佛经乐我也不喜欢，但是个人觉得她模仿cranberries没比原作差到
哪。
说国内音乐人模仿外国人就低档，基本是自卑心理作祟。何况人家也没宣扬自己这些都
是原创什么，我基本是先听欧美的再听国内的，没感觉被欺骗。各种演绎不同而已。
郑钧抄coldplay的那首yellow我也基本都是同期听到的，觉得都挺好听的，而且国内MV
拍的还好点。coldplay好多不错的歌，那MV拍的简直就是屎。
再说港台大陆模仿欧美日韩后，歌词我觉得都比原作更好点，更有意义点... 阅读全帖 |
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D*a
发帖数: 6830 | 40 多谢前辈提醒
knockin是基因置换吧，Tg是随机插入，对不？我上面混了
lz这种情况应该是Tg，不是knockin |
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c********o
发帖数: 135 | 41 即使是一个copy的Cre转基因也应该有control。记得nature发过一篇关于Cre的
toxicity的paper，大致是因为很多转基因的Cre都是很强的promoter驱动的，会影响插
入位点附近的基因表达。所以floxed/floxed并不是floxed/floxed;Cre的最好control
，应该是floxed/wt,Cre。
现在有一些cre是knockin在promoter下游的，至少位置是清楚的。另外一个办法是
knockin在Rosa26的位置。
Homo Cre有phenotype是挺有意思的，原来隔壁实验室就有过，但花了很多时间想搞清
楚插入位点，但最后是不了了之了。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 42 你想敲掉的基因的exon 两端先knockin flox element
然后和已经knockin 由某个特异pomoter 驱动的cre基因的老鼠杂交
杂交后代的老鼠，在某些组织里会表达cre蛋白，就把flox element 镶嵌的基因序列
剪掉了。 |
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b******r
发帖数: 111 | 43 Sorry for this confusion.
It is too early for me to talk about transgenic mice. I am just during
electroporation of construct into ES cells. My Southern doesn't work for
genotyping. I have to use PCR to isolate positive ES cell clones. Then I
need get a primer pair for genotyping. Forward primer is from Neo, reverse
is from outside. What I did is knockin,not knockout.
Without purification of genomic DNA(just heat to kill proteinase K),PCR
doesn't work. After purification, still doesn't work.
"你... 阅读全帖 |
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h******y
发帖数: 351 | 44 For the second question, the answer is Yes we can. There are several ways
to achieve this - Meganuclease such as ZFN or TALEN, or homologous rAAV
recombination.
Both ZFN and TALEN can make incisions on the chromosome DNA and then employ
non-homologous end-joining repair, which normally result in small deletion
in the endogenous loci to achieve knockout effect. But it is difficult to
knockin. For ZFN or TALEN, the biggest concern is off-target effect due to
the nature of these technologies.
rAA... 阅读全帖 |
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z*******o
发帖数: 1794 | 45 新的方法对于knockin效率高不高？做过的人能否说说。这边有用Zinc Finger做
knockin的，效率惨不忍睹。 |
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f******g
发帖数: 1003 | 46 其实，oncogene只是个定义，在基因芯片或者连锁分析发现一些基因在肿瘤中上调，然
后做了一些体外实验，就说这个基因是oncogene,
具体这些oncogene在体内的功能还需要进一步研究，knockin小鼠是不是会产生肿瘤，
如果是胚胎至死的，inducible knockin mouse是不是会引起肿瘤。
如果能引起肿瘤的话，才能说这个基因是oncogene. |
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s*********y
发帖数: 292 | 47 几个月前第一次做，3Xflag knockin，挑了20个克隆有俩
从那之后knockin就再也没成功过
knockout感觉确实挺好做的 |
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r********s
发帖数: 149 | 48 请问你这个knockin 花了多久 ？成功率有多高？是一个allele还是两个allele
knockin? |
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s******r
发帖数: 1245 | 49 western能测到表达低不到哪里去，没tag上的占大部分，flag tag上的只有一小部分
是不是克隆不纯，或者tag了之后对细胞有影响
先确认一下knockin做对了，然后测一下带flag的allele和不带的allele表达差多少
话说为了做个IF去弄个knockin真是蛋疼，有这功夫还不如去打几个新抗体出来 |
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L****T
发帖数: 169 | 50 你说的有道理，可能只knockin了一个allete，那最多一半的内源蛋白可以被tag。如果
再加上克隆不纯，就更加麻烦了。
可能楼主knockin不光是为了IF，还可以做ChIP、做IP，可以玩很多花样啊。 |
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