n******e
发帖数: 110 | 1 想要构建转入一个copy外源基因并稳定表达的细胞系.
请问用什么系统?
初步查了一下:
有Talen, Zinc finger.
请推荐价格便宜量又足的kit
谢谢! |
T****u
发帖数: 424 | 2 you need learn basic cell biology
【在 n******e 的大作中提到】
: 想要构建转入一个copy外源基因并稳定表达的细胞系.
: 请问用什么系统?
: 初步查了一下:
: 有Talen, Zinc finger.
: 请推荐价格便宜量又足的kit
: 谢谢!
|
n******e
发帖数: 110 | 3 惭愧。
对于真核生物外源基因表达不是很了解。也有可能是我一开始没有表达很清楚。
主要是因为通过质粒来建立的话对于整合位置，拷贝数目不可控制。
所以想通过这些方法，建立单拷贝，特定位置整合的细胞株。
不知道这个思路是不是存在什么错误，如果有简单的方法，还请指教。多谢多谢！
【在 T****u 的大作中提到】
: you need learn basic cell biology
|
m*********D
发帖数: 1727 | 4 十年不作这个了，看还记得不记得。
作stable cell line,要单拷贝，你不能切plasmid，要保持plasmid的环。但你不能保
证每个插入的位置（on plasmid），因此插入的位置可能正好在你的表达cassette中间
，所以，要花大量时间来挑选你要的细胞系（PCR应该可以证实）。linearized
plasmid才会有多copy问题。
另外，就是stable cell line的silence问题。你的表达基因会随culture时间而
silence。这个当时是在cassette两边加特定的sequence来防止的（我连名字度不既得
利益了。）。现在不知道是不是有新技术。
另外，我们以前是用bicistronic系统，就是selection marker和你要表达的基因在同
一个mRNA上，中间有一个ribosome进入的IRES sequence,保证两个蛋白质的
translation。这个的好处是能在selection条件下成活的细胞系，表达你的基因的可能
性也大多了。你可以参见clontec的系统。 |
T****u
发帖数: 424 | 5 Then that's knockin cell line to a specific position.
Cas9 and TALEN will help.
【在 n******e 的大作中提到】
: 惭愧。
: 对于真核生物外源基因表达不是很了解。也有可能是我一开始没有表达很清楚。
: 主要是因为通过质粒来建立的话对于整合位置，拷贝数目不可控制。
: 所以想通过这些方法，建立单拷贝，特定位置整合的细胞株。
: 不知道这个思路是不是存在什么错误，如果有简单的方法，还请指教。多谢多谢！
|
h***y
发帖数: 519 | 6 Flp in
【在 n******e 的大作中提到】
: 想要构建转入一个copy外源基因并稳定表达的细胞系.
: 请问用什么系统?
: 初步查了一下:
: 有Talen, Zinc finger.
: 请推荐价格便宜量又足的kit
: 谢谢!
|
n******e
发帖数: 110 | 7 多谢这么详细的解答!
还真的不知道这个线性化的trick.
不过,用质粒系统还是觉得会有像你说的silence的问题.
我就是用质粒系统做了瞬时转染,得到了初步结果.
还是十分感谢详细解答!
【在 m*********D 的大作中提到】
: 十年不作这个了，看还记得不记得。
: 作stable cell line,要单拷贝，你不能切plasmid，要保持plasmid的环。但你不能保
: 证每个插入的位置（on plasmid），因此插入的位置可能正好在你的表达cassette中间
: ，所以，要花大量时间来挑选你要的细胞系（PCR应该可以证实）。linearized
: plasmid才会有多copy问题。
: 另外，就是stable cell line的silence问题。你的表达基因会随culture时间而
: silence。这个当时是在cassette两边加特定的sequence来防止的（我连名字度不既得
: 利益了。）。现在不知道是不是有新技术。
: 另外，我们以前是用bicistronic系统，就是selection marker和你要表达的基因在同
: 一个mRNA上，中间有一个ribosome进入的IRES sequence,保证两个蛋白质的
|
n******e
发帖数: 110 | 8 谢谢指点!
我也是这么想的.就是想问问那个公司的kit效率高又便宜的.
【在 T****u 的大作中提到】
: Then that's knockin cell line to a specific position.
: Cas9 and TALEN will help.
|
n******e
发帖数: 110 | 9 多谢!
也有文献提到这个.
主要是不想自己折腾,还是买成熟的kit或者直接找公司做.
【在 h***y 的大作中提到】
: Flp in
|
