d****i
发帖数: 2346 | 1 做了一个实验，用药处理细胞后取mRNA，发现mRNA增加非常多。然后又做了一次试验取
protein，看看这个基因的蛋白 western水平有没有增加，结果发现蛋白水平没有增加
。因为一般来说mRNA增加很多protein也会相应增加。不知道是那里做错了，为了同时
做mRNA和protein，打算用dadish养细胞并加药处理，收集细胞后一分为二，分别做RNA
和protein。
打算这样做：收集细胞的时候先把细胞刮下来，离心后重悬，然后一分为二，分别加入
RNA和protein的lysis buffer。
问题：我还想用这些protein检测post-translational modifications，比如磷酸化乙
酰化什么的。
在收集细胞过程中，这些post-translational modifications可能改变，能不能用PBS
把medium洗掉之后用4%的formaldehyde固定一下细胞，保留所有post-translational
modifications？
请大家指点一下。谢谢！ |
T****i
发帖数: 15191 | 2 有用Trizol先提RNA再提蛋白的流程，你应该能google 到。不过不知道对于
posttranslational modifications怎么样。对于磷酸化，有一大堆phosphatase
inhibitors，最便宜的应该是Sodium Vanadate。不过一般几个同时用，才能抑制多种
phosphatase。
RNA
PBS
【在 d****i 的大作中提到】
: 做了一个实验，用药处理细胞后取mRNA，发现mRNA增加非常多。然后又做了一次试验取
: protein，看看这个基因的蛋白 western水平有没有增加，结果发现蛋白水平没有增加
: 。因为一般来说mRNA增加很多protein也会相应增加。不知道是那里做错了，为了同时
: 做mRNA和protein，打算用dadish养细胞并加药处理，收集细胞后一分为二，分别做RNA
: 和protein。
: 打算这样做：收集细胞的时候先把细胞刮下来，离心后重悬，然后一分为二，分别加入
: RNA和protein的lysis buffer。
: 问题：我还想用这些protein检测post-translational modifications，比如磷酸化乙
: 酰化什么的。
: 在收集细胞过程中，这些post-translational modifications可能改变，能不能用PBS
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d****i
发帖数: 2346 | 3
非常感谢！你说的那个先RNA后protein的方法我是知道的，但是我不想因为RNA提取过
程中给protein引入其他的杂质，比如残留的酚氯仿什么的。
【在 T****i 的大作中提到】
: 有用Trizol先提RNA再提蛋白的流程，你应该能google 到。不过不知道对于
: posttranslational modifications怎么样。对于磷酸化，有一大堆phosphatase
: inhibitors，最便宜的应该是Sodium Vanadate。不过一般几个同时用，才能抑制多种
: phosphatase。
:
: RNA
: PBS
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d****i
发帖数: 2346 | 4 另外我想的是4%的formaldehyde固定一下细胞可能会保留all kinds of post-
translational modifications,以后不管做啥拿来用就行了。 |
T****i
发帖数: 15191 | 5 PFA crosslinking火候不好掌握。不过以前看人做过。能做好的都是牛人啊。
【在 d****i 的大作中提到】
: 另外我想的是4%的formaldehyde固定一下细胞可能会保留all kinds of post-
: translational modifications,以后不管做啥拿来用就行了。
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s******s
发帖数: 13035 | 6 Trizol除了RNA，抽DNA和蛋白都很麻烦，样品够多的话还是分开来做吧
【在 T****i 的大作中提到】
: 有用Trizol先提RNA再提蛋白的流程，你应该能google 到。不过不知道对于
: posttranslational modifications怎么样。对于磷酸化，有一大堆phosphatase
: inhibitors，最便宜的应该是Sodium Vanadate。不过一般几个同时用，才能抑制多种
: phosphatase。
:
: RNA
: PBS
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d****i
发帖数: 2346 | 7
细胞系，样品足够多。但是我希望是同一个dish的treatment来的分别作RNA和protein
。
【在 s******s 的大作中提到】
: Trizol除了RNA，抽DNA和蛋白都很麻烦，样品够多的话还是分开来做吧
|
c********b
发帖数: 363 | 8 要不试试这个
http://www.clontech.com/US/Products/Nucleic_Acid_Purification/R
看你的RNA有多abundant和稳定了。我一般就是拿着1X的SDS－PAGE loading buffer把
蛋白提出来一半上样然后另一半用trizol或者RNAzol提，不过我加了酒精之后不是离心
沉淀而是用个柱子（其实质粒小提的柱子都可以）来纯化然后elute，反正做RT－PCR是
没有问题的。
protein
【在 d****i 的大作中提到】
:
: 细胞系，样品足够多。但是我希望是同一个dish的treatment来的分别作RNA和protein
: 。
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d****i
发帖数: 2346 | 9
谢谢！直接加入SDS－PAGE loading buffer对蛋白的各种posttranslational
modifications有保护作用吗？
【在 c********b 的大作中提到】
: 要不试试这个
: http://www.clontech.com/US/Products/Nucleic_Acid_Purification/R
: 看你的RNA有多abundant和稳定了。我一般就是拿着1X的SDS－PAGE loading buffer把
: 蛋白提出来一半上样然后另一半用trizol或者RNAzol提，不过我加了酒精之后不是离心
: 沉淀而是用个柱子（其实质粒小提的柱子都可以）来纯化然后elute，反正做RT－PCR是
: 没有问题的。
:
: protein
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c********b
发帖数: 363 | 10 做蛋白的话很多时候都是case－by－case的，你不试试怎么能完全知道呢？
【在 d****i 的大作中提到】
:
: 谢谢！直接加入SDS－PAGE loading buffer对蛋白的各种posttranslational
: modifications有保护作用吗？
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