y********8 发帖数: 23 | 1 我用joint PCR将两个3k和4k的片段连接在一起, 结果除了7k的目的片段之外,始终有
一条很强的4k左右的片段,想请教如何去除4k的片段,我不想做gel cutting和再次PCR
,怕引入mutations.
谢谢!!! |
e****s 发帖数: 1125 | 2 你确定这个4k的不是上轮那4k的片断?
你说的joint就是overlapping吧?overlapping PCR有很多做法,要看你的protocol才
能分析啊。比如是否加入primers?还是直接加入大量的A片断和B片断。 |
M******g 发帖数: 152 | 3 You should try Gibson assembly from NEB. It is very easy to assemble
fragments.
Learn more about Gibson assembly, check out the link below:
https://www.neb.com/applications/cloning-and-mapping/gibson-assembly |
b******k 发帖数: 1874 | 4 可以试试直接,连接,转化ecoli:
1 如果那4k的杂带没有对应的霉切位点,不会被链接。
2 如果转化了,有可能通过plasmid 电泳区分出来。
3 再不济,用菌落pcr筛选
PCR
【在 y********8 的大作中提到】 : 我用joint PCR将两个3k和4k的片段连接在一起, 结果除了7k的目的片段之外,始终有 : 一条很强的4k左右的片段,想请教如何去除4k的片段,我不想做gel cutting和再次PCR : ,怕引入mutations. : 谢谢!!!
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b*********b 发帖数: 64 | 5 gel purification没那么容易引入mutation的,只要你不用紫外使命的照。我做过的克
隆多到没法数,从来都做gel purification,2k以下的片段,我最多挑4个克隆去测序
,大部分时候是100%正确,还从来没遇到拿不到正确克隆的时候,而且做了gel
purification,会给你后来的几步省去很多麻烦。
照胶的时候放个尺子在你的gel旁边,这样你就知道该往哪割了。我用紫外最多不超过
30s。你要担心胶纯化后7k片段浓度太低,同时做几管PCR,全部跑胶。
PCR
【在 y********8 的大作中提到】 : 我用joint PCR将两个3k和4k的片段连接在一起, 结果除了7k的目的片段之外,始终有 : 一条很强的4k左右的片段,想请教如何去除4k的片段,我不想做gel cutting和再次PCR : ,怕引入mutations. : 谢谢!!!
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b******k 发帖数: 1874 | 6 我也同意。连接产物纯了,后面做起来会更顺利。
【在 b*********b 的大作中提到】 : gel purification没那么容易引入mutation的,只要你不用紫外使命的照。我做过的克 : 隆多到没法数,从来都做gel purification,2k以下的片段,我最多挑4个克隆去测序 : ,大部分时候是100%正确,还从来没遇到拿不到正确克隆的时候,而且做了gel : purification,会给你后来的几步省去很多麻烦。 : 照胶的时候放个尺子在你的gel旁边,这样你就知道该往哪割了。我用紫外最多不超过 : 30s。你要担心胶纯化后7k片段浓度太低,同时做几管PCR,全部跑胶。 : : PCR
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C*******e 发帖数: 4348 | 7 顶三楼
推荐Gibson Assembly
还有Clontech家的叫HD Fusion的
两个原理差不多
做出来没有scar,不需要考虑酶切的问题
总有一天传统酶切再连接的方法会退出舞台的 |
s******s 发帖数: 13035 | 8 gibson这个mix真tmd的死贵。有公司做山寨么,看上去成本没啥啥
【在 C*******e 的大作中提到】 : 顶三楼 : 推荐Gibson Assembly : 还有Clontech家的叫HD Fusion的 : 两个原理差不多 : 做出来没有scar,不需要考虑酶切的问题 : 总有一天传统酶切再连接的方法会退出舞台的
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C*******e 发帖数: 4348 | 9 gibson的那个不知道有没有人山寨
HD Fusion那个据我所知有实验室自己制备mix的
好像是个特殊的菌种,然后用cell lysate作为mix
具体的没能打探到
【在 s******s 的大作中提到】 : gibson这个mix真tmd的死贵。有公司做山寨么,看上去成本没啥啥
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N2 发帖数: 81 | 10 We did Gibson just after his paper published and never buy kit.
Just need order enzymes and follow his protocol.
【在 C*******e 的大作中提到】 : gibson的那个不知道有没有人山寨 : HD Fusion那个据我所知有实验室自己制备mix的 : 好像是个特殊的菌种,然后用cell lysate作为mix : 具体的没能打探到
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H*******i 发帖数: 196 | 11 各种方法都有优缺点,合理使用才是关键
如果要构建大量同系列克隆,酶切连接自然有优势(至少不用成天买primer),而且在
最后成环一步,酶切连接也是最robust的方法之一(有时二级结构对Gibson/Slic有点
影响,尤其是一律50°C的反应,基于PCR和recombination的问题就更多了。) Scar
只要用overlapping PCR解决就是了。
当然完全构建一个全新的,一次性的需要大量不同片段的东西,自然Gibson assembly
类方法有优势(做特别大的片段也有优势)
Gibson得话 T5 exonuclease https://www.neb.com/products/m0363-t5-exonuclease
Taq ligase https://www.neb.com/products/m0208-taq-dna-ligase
加上polymerase
就两三刀吧。
Slic一样片段,只用T4 DNApolymerase,两片段效率大概低两个数量级。
另外LZ你需不需要额外纯化是根据你片段性质来得,你7kb的是啥? insert得话必须
纯化,无论什么方法(小片段干扰太大)。 Backbone如果你确定Ori和筛选基因不会
同时出现在4KB片段上得话,偷懒也可以。不过mutation肯定不是关键需要考虑的问题
。
【在 C*******e 的大作中提到】 : 顶三楼 : 推荐Gibson Assembly : 还有Clontech家的叫HD Fusion的 : 两个原理差不多 : 做出来没有scar,不需要考虑酶切的问题 : 总有一天传统酶切再连接的方法会退出舞台的
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w********a 发帖数: 324 | 12 搭车问一个PCR的问题:
我用做完的PCR product,作为template,继续做PCR
,想得到更高浓度的产物;但总是不成功。要么干脆没有条带,要么有比较强的
unspecific的杂带。不知道您有什么好的建议。。
我试过用做完PCR的mixture直接作为template,也试过先clean-up一下,或者切胶纯化
一下,都不成功。不知道为什么?
非常感谢。
Scar
assembly
exonuclease
【在 H*******i 的大作中提到】 : 各种方法都有优缺点,合理使用才是关键 : 如果要构建大量同系列克隆,酶切连接自然有优势(至少不用成天买primer),而且在 : 最后成环一步,酶切连接也是最robust的方法之一(有时二级结构对Gibson/Slic有点 : 影响,尤其是一律50°C的反应,基于PCR和recombination的问题就更多了。) Scar : 只要用overlapping PCR解决就是了。 : 当然完全构建一个全新的,一次性的需要大量不同片段的东西,自然Gibson assembly : 类方法有优势(做特别大的片段也有优势) : Gibson得话 T5 exonuclease https://www.neb.com/products/m0363-t5-exonuclease : Taq ligase https://www.neb.com/products/m0208-taq-dna-ligase : 加上polymerase
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C*******e 发帖数: 4348 | 13 这个说的在理
不过primer方面好像并没有能省什么
如果只是一个insert片段,的确两种方法区别不算大
但如果是好多个片段首尾相连,Gibson Assembly优势显而易见
特别是vector还有最终construct都比较大,很难选择restriction enzyme的时候(要
不就是要买新的很不常见的酶,要不就是某些fragment要先做mutation PCR去除要用的
酶切位点)
Scar
assembly
exonuclease
【在 H*******i 的大作中提到】 : 各种方法都有优缺点,合理使用才是关键 : 如果要构建大量同系列克隆,酶切连接自然有优势(至少不用成天买primer),而且在 : 最后成环一步,酶切连接也是最robust的方法之一(有时二级结构对Gibson/Slic有点 : 影响,尤其是一律50°C的反应,基于PCR和recombination的问题就更多了。) Scar : 只要用overlapping PCR解决就是了。 : 当然完全构建一个全新的,一次性的需要大量不同片段的东西,自然Gibson assembly : 类方法有优势(做特别大的片段也有优势) : Gibson得话 T5 exonuclease https://www.neb.com/products/m0363-t5-exonuclease : Taq ligase https://www.neb.com/products/m0208-taq-dna-ligase : 加上polymerase
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H*******i 发帖数: 196 | 14 举个例子,如果你构建一大堆东西结构都是类似的,并且你需要尝试不同的组合
part1=Ori+resistance part2=upelements&promoter part3=rbs part4=cds
如果用gibson,要么使用一段长的共同序列作为连接部分,否则任意两个的组合都需要
一个引物,如果使用酶切连接,只需要在分割位点给一个scar就可以了(如果需要
seamless,可以使用BsaI类的酶)
至于我选用restriction enzyme,如果确定了,就会一直用下去,只是为了标准化构建
,不会去考虑cds里面有没有这种问题的(有就突变掉,如果因为有就要换酶那么当然
不如Gibson/CPEC类的策略)
【在 C*******e 的大作中提到】 : 这个说的在理 : 不过primer方面好像并没有能省什么 : 如果只是一个insert片段,的确两种方法区别不算大 : 但如果是好多个片段首尾相连,Gibson Assembly优势显而易见 : 特别是vector还有最终construct都比较大,很难选择restriction enzyme的时候(要 : 不就是要买新的很不常见的酶,要不就是某些fragment要先做mutation PCR去除要用的 : 酶切位点) : : Scar : assembly
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H*******i 发帖数: 196 | 15 你说的不是很清楚,
不过在我实验中有很多情况,如果第一次PCR杂带比目标带小,1是引物多聚体 2是目标
片段自身有些二级结构,包括重复序列 3是引物可以binding到非特异位点。 很多情况
是解决不了的。
如果你的目的是克隆,那么只要在胶上能看到(设计没问题的话),基本就是可以做出
来的。
我一般就做两件事
1.检查引物,另外看看片段里有没有重复序列,很多早期载体/基因片段里面有很多乱
七八糟东西,比如pET系列载体里面有段tetracycline resistance gene残余什么的。
2.换酶,越是结构复杂,包括terminator,重复序列(反向重复),不同酶表现差异越
大。(我是不到没有办法从来不优化体系的)
【在 w********a 的大作中提到】 : 搭车问一个PCR的问题: : 我用做完的PCR product,作为template,继续做PCR : ,想得到更高浓度的产物;但总是不成功。要么干脆没有条带,要么有比较强的 : unspecific的杂带。不知道您有什么好的建议。。 : 我试过用做完PCR的mixture直接作为template,也试过先clean-up一下,或者切胶纯化 : 一下,都不成功。不知道为什么? : 非常感谢。 : : Scar : assembly
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b*********b 发帖数: 64 | 16 通常引物与线性template末端binding不好,这种时候用两对引物比较好,第二对比第
一对往template中心移一点,移个四五个碱基就好了,有点像nested PCR。
【在 w********a 的大作中提到】 : 搭车问一个PCR的问题: : 我用做完的PCR product,作为template,继续做PCR : ,想得到更高浓度的产物;但总是不成功。要么干脆没有条带,要么有比较强的 : unspecific的杂带。不知道您有什么好的建议。。 : 我试过用做完PCR的mixture直接作为template,也试过先clean-up一下,或者切胶纯化 : 一下,都不成功。不知道为什么? : 非常感谢。 : : Scar : assembly
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w********a 发帖数: 324 | 17 非常感谢你的回复。
我的意思是说,第一次PCR可以做出想要的条带。即便第一次PCR产物中没有其他非特异
性条带(或者通过切胶纯化想要的条带),然后再用这个产物作为template,用同样的
酶,同样的条件做二次PCR,却总是做不出来。。
另外,关于Gibson Assembly的Master Mix,放狗找到了下面的配方;看上去跟作者原
文中的配方基本差不多;不过有个如此详细的配方(有NEB的Cat. No.)还是比较省事
。。
哪位兄弟可以试试,回来汇报一下:
http://ethanomics.files.wordpress.com/2013/06/2x-gibson-assembl
http://ethanomics.wordpress.com/gibson-assembly-master-mix/
谢谢
【在 H*******i 的大作中提到】 : 你说的不是很清楚, : 不过在我实验中有很多情况,如果第一次PCR杂带比目标带小,1是引物多聚体 2是目标 : 片段自身有些二级结构,包括重复序列 3是引物可以binding到非特异位点。 很多情况 : 是解决不了的。 : 如果你的目的是克隆,那么只要在胶上能看到(设计没问题的话),基本就是可以做出 : 来的。 : 我一般就做两件事 : 1.检查引物,另外看看片段里有没有重复序列,很多早期载体/基因片段里面有很多乱 : 七八糟东西,比如pET系列载体里面有段tetracycline resistance gene残余什么的。 : 2.换酶,越是结构复杂,包括terminator,重复序列(反向重复),不同酶表现差异越
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C*******e 发帖数: 4348 | 18 你说的不就是类似BglBricks的策略嘛
“不会去考虑cds里面有没有这种问题的(有就突变掉)”
——我说的就是这个问题啊,突变掉这一步也是需要设计引物、增加步骤的
而且这些BioBricks的策略还是要一步一步来组装
当然有的更复杂一些的,酶切位点不在识别位点上的,有可能一步来
反正各种方法各有利弊吧
一个看具体要做什么
另外就是看个人习惯了
没必要非争个长短
【在 H*******i 的大作中提到】 : 举个例子,如果你构建一大堆东西结构都是类似的,并且你需要尝试不同的组合 : part1=Ori+resistance part2=upelements&promoter part3=rbs part4=cds : 如果用gibson,要么使用一段长的共同序列作为连接部分,否则任意两个的组合都需要 : 一个引物,如果使用酶切连接,只需要在分割位点给一个scar就可以了(如果需要 : seamless,可以使用BsaI类的酶) : 至于我选用restriction enzyme,如果确定了,就会一直用下去,只是为了标准化构建 : ,不会去考虑cds里面有没有这种问题的(有就突变掉,如果因为有就要换酶那么当然 : 不如Gibson/CPEC类的策略)
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H*******i 发帖数: 196 | 19 我意思就是要看具体做什么灵活选择,而不是单纯比较策略好坏
比如构建A+B+C
其中A有x个 B有y个 C有Z个,我会在连接位置给三个酶切位点(个人觉得就算少量突
变也是值得的)。
如果是关键区域的组合,比如A-B中间是确定的序列,我会选择BsaI
如果是把一个片段加到所有质粒里(比如加tag),我会用Gibson assembly/CPEC(根
据插入片段长度,原质粒序列复杂度,当然也可以选择overlap PCR+酶切连接做)
构建新质粒,从时间上来说各个方法都差不多,因为Gibson对于多片段连接相对容易,
所以应该是最快的(不过片段太多也需要先PCR连起来),CPEC我只用两片段连接(有
时需要一次额外的overlapping PCR),酶切连接(三片段最多了)大概比CPEC多用1.
5h时间。 不过无论哪种方法,拿到引物后基本当天都能做完。。所以一般只考虑成功
率和后续实验设计问题。
【在 C*******e 的大作中提到】 : 你说的不就是类似BglBricks的策略嘛 : “不会去考虑cds里面有没有这种问题的(有就突变掉)” : ——我说的就是这个问题啊,突变掉这一步也是需要设计引物、增加步骤的 : 而且这些BioBricks的策略还是要一步一步来组装 : 当然有的更复杂一些的,酶切位点不在识别位点上的,有可能一步来 : 反正各种方法各有利弊吧 : 一个看具体要做什么 : 另外就是看个人习惯了 : 没必要非争个长短
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C*******e 发帖数: 4348 | 20 赞“不过无论哪种方法,拿到引物后基本当天都能做完”
另外借楼贴一个科普贴
介绍几种cloning methods的
http://j5.jbei.org/j5manual/pages/22.html
【在 H*******i 的大作中提到】 : 我意思就是要看具体做什么灵活选择,而不是单纯比较策略好坏 : 比如构建A+B+C : 其中A有x个 B有y个 C有Z个,我会在连接位置给三个酶切位点(个人觉得就算少量突 : 变也是值得的)。 : 如果是关键区域的组合,比如A-B中间是确定的序列,我会选择BsaI : 如果是把一个片段加到所有质粒里(比如加tag),我会用Gibson assembly/CPEC(根 : 据插入片段长度,原质粒序列复杂度,当然也可以选择overlap PCR+酶切连接做) : 构建新质粒,从时间上来说各个方法都差不多,因为Gibson对于多片段连接相对容易, : 所以应该是最快的(不过片段太多也需要先PCR连起来),CPEC我只用两片段连接(有 : 时需要一次额外的overlapping PCR),酶切连接(三片段最多了)大概比CPEC多用1.
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C**S 发帖数: 522 | 21 谢谢科普贴。
【在 C*******e 的大作中提到】 : 赞“不过无论哪种方法,拿到引物后基本当天都能做完” : 另外借楼贴一个科普贴 : 介绍几种cloning methods的 : http://j5.jbei.org/j5manual/pages/22.html
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d****i 发帖数: 2346 | |
h**********r 发帖数: 671 | 23 我准备考虑Gibson assembly了,先问你一个很挫的问题哈。
1).比如我用EcoRI线性化质粒,作为assembly的一部分。切开后是这样子的吧?
------G AATTC-------
------CTTAA G-------
vector的两头不是平末端了,应该怎么设计overlap啊?还是两边直接用EcoRI (GAATTC
)的序列?感觉又不完全互补了。如果用overhang的话,只和一条链互补,那样EcoRI就
没了?这个nick是咋整的呢?
2).另外今天又挫了一把,在IDT合成两个片段忘记加overlap了。只能再靠PCR的引物加
这个overlap。他家的750bp-510bp一个价。应该刚好合成到750bp左右。这个overlap多
长比较合适?NEB说20bp多够了,有的说不够。
2).另外一个问题:可以把Gibson assembly的产物直接作为模板PCR得到全长吧?要表
达的制粒不方便测序。想把得到PCR产物一部分用来酶切克隆表达,一部分用来AT克隆
测序。
多谢了!
【在 C*******e 的大作中提到】 : 这个说的在理 : 不过primer方面好像并没有能省什么 : 如果只是一个insert片段,的确两种方法区别不算大 : 但如果是好多个片段首尾相连,Gibson Assembly优势显而易见 : 特别是vector还有最终construct都比较大,很难选择restriction enzyme的时候(要 : 不就是要买新的很不常见的酶,要不就是某些fragment要先做mutation PCR去除要用的 : 酶切位点) : : Scar : assembly
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C*******e 发帖数: 4348 | 24 对于问题(1),就是你把自己最后要得到的质粒用手画也好,用软件也好,序列整出来
把inseert的部分highlight
就可以看的比较清楚了
决定好insert的部分以后,再往上游数个15-20bp(看手册怎么说)就可以
Gibson的是从5'端chew back
你可以选择保留质粒上的酶切位点(比如你这里的EcoRI)或者不保留
看你需要
所以如果保留位点就是
------G AATTinsert AATTC-------
------CTTAA insertTTAA G-------
如果不保留位点,就是这样:
------G insert (AATTC)-------
------C(TTAA) insert G-------
(括号里面因为5' chew back,而且insert上的flanking region不带这个“AATT”,
就失去了)
我一般还是选择保留酶切位点,这样的好处是如果这个片段我以后还想用来做别的
我还是可以用酶切的方法取出来,而不用再设计一次引物
另外没有明白第二个问题
如果你已经在合成一个基因了,干嘛不一步到位,而是还要自己折腾啊?
GAATTC
【在 h**********r 的大作中提到】 : 我准备考虑Gibson assembly了,先问你一个很挫的问题哈。 : 1).比如我用EcoRI线性化质粒,作为assembly的一部分。切开后是这样子的吧? : ------G AATTC------- : ------CTTAA G------- : vector的两头不是平末端了,应该怎么设计overlap啊?还是两边直接用EcoRI (GAATTC : )的序列?感觉又不完全互补了。如果用overhang的话,只和一条链互补,那样EcoRI就 : 没了?这个nick是咋整的呢? : 2).另外今天又挫了一把,在IDT合成两个片段忘记加overlap了。只能再靠PCR的引物加 : 这个overlap。他家的750bp-510bp一个价。应该刚好合成到750bp左右。这个overlap多 : 长比较合适?NEB说20bp多够了,有的说不够。
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h**********r 发帖数: 671 | 25 谢谢,解释得非常清楚。我用软件画质粒的。酶切连接克隆做了也不下几千个了。你这
个5' chew back解释得非常好,Gibson assembly把这个给削平了。就是说这个也可以
和yeast recombination一样,中间引入一小段和两头儿都不同源的序列。
是因为最近IDT公司只合成750bp以下比较便宜,所以我分段合成,然后要assembly。猥
琐了一把。
多谢! |