d*****i
发帖数: 3905 | 1 大家有没有遇到过这样的情况，细胞加了virus后直接puromycin selection一段时间，
第一次做qPCR发现knockdown efficiency不错，细胞再养一段时间后qPCR发现
efficiency变差了。
有人解释说是细胞中KD efficiency高的没有低的分裂速度快，所以养一段时间后KD
efficiency高的细胞就没有低的多，总体efficiency就变差了。
有人遇到过同样情况吗？都是怎么解决的？谢谢！！ |
r***e
发帖数: 2539 | 2 这是肯定的，如果KD对生长有劣势。
可以试试增加puro浓度，但是puro表达和shRNA表达可能不是线性的。
要解决只能挑克隆了。
【在 d*****i 的大作中提到】
: 大家有没有遇到过这样的情况，细胞加了virus后直接puromycin selection一段时间，
: 第一次做qPCR发现knockdown efficiency不错，细胞再养一段时间后qPCR发现
: efficiency变差了。
: 有人解释说是细胞中KD efficiency高的没有低的分裂速度快，所以养一段时间后KD
: efficiency高的细胞就没有低的多，总体efficiency就变差了。
: 有人遇到过同样情况吗？都是怎么解决的？谢谢！！
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d*****i
发帖数: 3905 | 3 如果shRNA表达了应该puro-resisted gene也表达了吧，增加puro浓度应该没啥作用吧
【在 r***e 的大作中提到】
: 这是肯定的，如果KD对生长有劣势。
: 可以试试增加puro浓度，但是puro表达和shRNA表达可能不是线性的。
: 要解决只能挑克隆了。
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s******s
发帖数: 13035 | 4 应该没啥用。根本不是一个promoter，再说puro抗性很强，对dose不太敏感。
这种实验就是做短期的，一两个礼拜内搞定。长期表达不利的shRNA或者转基因，
细胞多半就抑制表达了。有两个办法，一个是连个T2A的抗性，不过细胞其他基
因也可能变化来抵消你得影响；另一个就是做inducible的系统
【在 d*****i 的大作中提到】
: 如果shRNA表达了应该puro-resisted gene也表达了吧，增加puro浓度应该没啥作用吧
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a********a
发帖数: 428 | 5 有没有同学遇到shrna包装成lentivirus后，不能knock down targeted protein了、、
没有包装成lentivirus之前，kd效果还不错。。。 |
r***e
发帖数: 2539 | 6 作用不大，但是有可能enrich multiple copy integration。
一个细胞感染多个病毒。但是shRNA和puro表达量不一定线性。
【在 d*****i 的大作中提到】
: 如果shRNA表达了应该puro-resisted gene也表达了吧，增加puro浓度应该没啥作用吧
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r***e
发帖数: 2539 | 7 这个一般是因为transfection进去的质粒多，infection病毒比较少。
【在 a********a 的大作中提到】
: 有没有同学遇到shrna包装成lentivirus后，不能knock down targeted protein了、、
: 没有包装成lentivirus之前，kd效果还不错。。。
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a*******a
发帖数: 4233 | 8 这个很常见, 如果KD后抑制生长就会这样
解决方法是快点做完,每次用新鲜感染的.
【在 d*****i 的大作中提到】
: 大家有没有遇到过这样的情况，细胞加了virus后直接puromycin selection一段时间，
: 第一次做qPCR发现knockdown efficiency不错，细胞再养一段时间后qPCR发现
: efficiency变差了。
: 有人解释说是细胞中KD efficiency高的没有低的分裂速度快，所以养一段时间后KD
: efficiency高的细胞就没有低的多，总体efficiency就变差了。
: 有人遇到过同样情况吗？都是怎么解决的？谢谢！！
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p*****e
发帖数: 93 | 9 That's normal, To most of knockdowns, the efficiency decreases with passages
. usually, after 20 passages, the knockdown is terrible.
【在 d*****i 的大作中提到】
: 大家有没有遇到过这样的情况，细胞加了virus后直接puromycin selection一段时间，
: 第一次做qPCR发现knockdown efficiency不错，细胞再养一段时间后qPCR发现
: efficiency变差了。
: 有人解释说是细胞中KD efficiency高的没有低的分裂速度快，所以养一段时间后KD
: efficiency高的细胞就没有低的多，总体efficiency就变差了。
: 有人遇到过同样情况吗？都是怎么解决的？谢谢！！
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q******g
发帖数: 3858 | 10 我一般做完transduction后，马上冻上一批。等knockdown不好的时候,就再拿出来用新
的.效果还不错. |
d*****i
发帖数: 3905 | 11 请教大牛具体解释下T2A和inducible的系统？？
【在 s******s 的大作中提到】
: 应该没啥用。根本不是一个promoter，再说puro抗性很强，对dose不太敏感。
: 这种实验就是做短期的，一两个礼拜内搞定。长期表达不利的shRNA或者转基因，
: 细胞多半就抑制表达了。有两个办法，一个是连个T2A的抗性，不过细胞其他基
: 因也可能变化来抵消你得影响；另一个就是做inducible的系统
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S*********s
发帖数: 304 | 12 T2A
your-gene-T2A site-puro
在同一个mRNA表达，表达cDNA可以用。
google
The ‘cleavage’ activities of foot-and-mouth disease virus 2A
site-directed mutants and naturally occurring ‘2A-like’
sequences
inducible system
请参考
Wee, S., Wiederschain, D., Maira, S.-M., Loo, A., Miller, C., deBeaumont, R.
, Stegmeier, F., Yao, Y.-M., and Lengauer, C. PTEN-deficient cancers depend
on PIK3CB, Proc Natl Acad Sci U S A. 105: 13057-62, 2008
http://www.addgene.org/21915/
另外还有两载体系统
pCMV6-TetR
TO-shRNA
很多公司都有，google
你现在的stable cell可以FACS sorting, or diulte to get single clone,看看
single clone的knockdown efficiency.
如果是对生长有影响的话，弄成单克隆之后应该就没问题了。
Good luck!
【在 d*****i 的大作中提到】
: 请教大牛具体解释下T2A和inducible的系统？？
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d*****i
发帖数: 3905 | 13 谢谢~
我现在用的是pKLO.1，没有连GFP，所以没法做FACS。。。
不知最早都是怎么注意到KD和生长速度有关？culture时观察发现的？
R.
【在 S*********s 的大作中提到】
: T2A
: your-gene-T2A site-puro
: 在同一个mRNA表达，表达cDNA可以用。
: google
: The ‘cleavage’ activities of foot-and-mouth disease virus 2A
: site-directed mutants and naturally occurring ‘2A-like’
: sequences
: inducible system
: 请参考
: Wee, S., Wiederschain, D., Maira, S.-M., Loo, A., Miller, C., deBeaumont, R.
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