L****e
发帖数: 499 | 1 我现在要研究一个突变的蛋白，想知道是否这个突变影响到它的磷酸化，当然，不一定
是该突变位点的磷酸化，也可能是其它的位点，但是这个蛋白的已经报道的磷酸化的位
点就有很多，我又不能买所有的抗体一个一个来试，而且还有的发表的文章中磷酸化的
抗体还没得卖的，是他们自己制备的。
我有 Abcam 的 Anti-Phosphoserine antibody (ab9332) 抗体，我想用这个抗体做IP
，然后用我的那个蛋白的抗体做WB, wild type 和 mutated 来比较是不是就可以比较
出磷酸化水平的差异呢？ 我本来是先用我的那个蛋白的抗体做IP，然后用 Anti-
Phosphoserine antibody 做blot 的，但是什么都没有做出来。
我想请问一下有这方面经验的同仁，这样的设计是否合理。我想先看总的磷酸化水平有
没有差异，然后再考虑针对某特定位点。
多谢了 |
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p*****n
发帖数: 981 | 2 ☆─────────────────────────────────────☆
stevenzhu (steven) 于 (Sun Feb 11 16:12:44 2007) 提到:
我已知某个蛋白的某位点是tyrosine磷酸化位点，用promega的alkaline phosphatase
40 ul加到bacteria的cell lysates里（50ml pelletes）将该蛋白去磷酸化，然后做了
ip, 再用识别该特异位点磷酸化的抗体检测，却还是有信号。重复了好几遍实验都是这
样。请问大家可能是什么原因？
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ankyrin (漂泊Boston) 于 (Sun Feb 11 16:49:52 2007) 提到:
也可能是你的抗体的问题，磷酸化抗体经常对非磷酸化的蛋白也有一点背景亲和力
也可能是你抗原量太大了导致的背景信号
你可以把这个位点突变掉试试
phosphatase
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lanceandfe |
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l******a
发帖数: 3339 | 3 如题，本人生物小菜鸟，已知某蛋白某位点磷酸化，并且对蛋白作用很重要，请问怎么
找相应的激酶
和磷酸化酶，另外找磷酸化酶有意义吗？（听说磷酸化酶都比较不specific。） |
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s******y
发帖数: 28562 | 4 有没有人知道有什么例子里，一个蛋白的磷酸化既能改变它的活性（比方说对
下游靶蛋白的磷酸化增强，或者对其他蛋白结合里增强），同时又加快它的
降解速度的？
这种例子理论上应该是有的，比方说一个蛋白不磷酸化的时候分子是合起来的，没有活
性，但是一旦磷酸化后把蛋白展开来了，活性基团暴露出来的同时也就招来Ubiquitin
ligase所以降解变快，等等，似乎上学的时候再在生化课还听过。但是我一下子实在想
不起什么事例来了。哪位同学知道的来指点一下？先谢过了！ |
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i*****i
发帖数: 154 | 5 现在手里的一个课题，想继续做一些生化方面的研究。
已知蛋白E可以和我的目的蛋白L结合。基于各种实验中遇到的痛苦经验，以及对蛋白L
的序列结构分析（存在大量磷酸化motif），我认为蛋白E与蛋白L的结合可以稳定蛋白L
。但是随着时间的推移，加诸其他的外界条件，这个L仍然会被磷酸化。
现在我想证明
1）蛋白E与L的结合，增加了L的稳定性（已知E非常稳定）
2）这种稳定性来源于阻止了某些位点的磷酸化
3）如何证明某一个pathway（AKT or ERK or ...)是负责这个蛋白磷酸化的。
请问版上的生化牛人，怎么设计一些实验来证明呢？ |
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o**d
发帖数: 3080 | 6 1， 表达E，L ，E＋L，看看有E的情况下L是否更稳定（首先假设E和L在293cell里是能
结合的。而且你需要很多control，来证明这个由于蛋白的稳定性造成的）。也可以用E
的KO 或KD细胞来看L是否更不稳定。
2，突变你认为的L上的磷酸化位点，重复实验1，
3，先查一下有没有人报道L被AKT 或ERK磷酸化。然后看看AKT／ERK KO （KD） cell里
L的磷酸化是否降低（如果有磷酸化抗体的话）。还可以看L是否更稳定。
L
白L |
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s*****r
发帖数: 7 | 7 首先，你的蛋白是多位点磷酸化的,先用anti-Pser做IP,不管wild type和mutant可能都
会抓下来,后面的blot还是没区别.
建议：
1 现在有个叫phostag的试剂，可以通过SDS-PAGE条带区别出不同磷酸化状态，在配胶
的时候加入，run gel后用你蛋白的抗体blot，用这个可以粗略分析。
2 如果想知道突变影响的具体磷酸化位点，那可以就把两个蛋白表达纯化出来，typsin
酶解后找个kit（GL sciences，Sigma，Promega等）提取磷酸肽，然后上质谱鉴定各自
的磷酸化位点吧。
IP |
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d****i
发帖数: 2346 | 8 我们使用的是荧光二抗，就是licor的那个，不是HRP，做某蛋白的磷酸化分析，
western。
问题一，一般是先上磷酸化抗体，strip之后再上total抗体，但是这种二抗strip掉信
号很困难，大家有什么好办法？
问题二，western里有磷酸化抗体的信号，total蛋白的信号，还有actin的信号，怎么
计算磷酸化信号的强弱？
谢谢！ |
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x*********n
发帖数: 43 | 9 苦逼做植物的，想看看一个蛋白在某种处理后有没有磷酸化修饰。现在已经有挂了标签
的我的蛋白的转基因植株。初步是想用标签IP下来用磷酸化的抗体来做WB，可是听说常
用的4G10抗体对植物蛋白不怎么好用？有没有谁能推荐一个针对植物蛋白好用的呀？
其实更像用磷酸化的beads把总蛋白里磷酸化了的蛋白拉下来，然后用我的蛋白上的特
异性的标签来做WB，感觉更有说服力。可是没找到这种beads。。。谁有信息的话能否
提供一下呢
谢谢啊 |
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发帖数: 1 | 10 实验室在做一个磷酸化的蛋白，需要做个抗体检测它。磷酸化的位点已经找到，所以需
要先合成一个磷酸化的多肽，再拿去制备多抗。大家推荐个做的好的公司。 万分感谢
！ |
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e*******c
发帖数: 1479 | 11 各位同仁，AKT308的磷酸化调控对于473的磷酸化有何作用？ PI3K通过PDK1调控着308
，然后如何作用于473的？auto磷酸化的作用？
我们发现一个非PI3K依赖性的473变化，该如何解释呢？谢谢 |
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e*r
发帖数: 103 | 12 发现某个蛋白如果被磷酸化就定位到膜上，如果去磷酸化就循环到细胞内。 你认为是
磷酸化后，别的蛋白帮助此蛋白上膜？ |
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t**d
发帖数: 52 | 13 这种方法可行吗？比如观察p38的磷酸化，用p-P38 Ab做免疫组化？，但我研究的蛋白
的磷酸化抗体都是针对某一磷酸化位点的，例如p-Tyr,通常用来IP的，如果做组化，假
阳性一堆 |
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m*******3
发帖数: 25 | 14 我想检测一个激酶对底物的磷酸化，从大肠杆菌中纯化了蛋白，进行体外磷酸化反应，
然后用
sigma的丝氨酸特异的磷酸化抗体进行检测，结果发现预染的marker显出了非常深的带
，不知为什
么，谢谢大家！ |
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x*********n
发帖数: 43 | 15 做植物的，想用inhibitor处理植物抑制磷酸化（不是抑制磷酸化酶），请问有什么推
荐吗？
还有抑制mRNA降解的inhibitor有吗？
还有，抑制磷酸化酶的用roche的PhoSTOP行么？
问题有点多，谢谢 |
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s******y
发帖数: 28562 | 16 磷酸化的带在SDS page 上跑的快慢和蛋白对SDS 的结合程度有关，和分子量无关。这
个是生化的常识，但是很多人（包括很多资深PI) 对此有误会。
磷酸化的带既可能比原来的带高，也可能不变，变低的也有，虽然比较罕见。但是如果
你们的实验是在细胞内做的，的确是有可能磷酸化之后引起了limited proteolysis。
如果不敢确认，最直接的方法是把你所怀疑的带切下来跑个质谱。 |
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L*********g
发帖数: 3001 | 17 问一个蛋白磷酸化的问题
要从6孔板里提蛋白，检测磷酸化，由于细胞密度比较低，能否直接把大约200 ul的2 X
laemmli buffer加到孔里，迅速刮下来，然后煮5分钟？整个过程很快，从加buffer到
放到heat block上，在1分钟内完成。
请问，这样做可以么？会不会导致磷酸化消失？
如果这样做不好，还有别的什么办法？
谢谢。 |
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发帖数: 1 | 18 实验室在做一个磷酸化的蛋白，需要做个抗体检测它。磷酸化的位点已经找到，所以需
要先合成一个磷酸化的多肽，再拿去制备多抗。大家推荐个做的好的公司。 万分感谢
！ |
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r****r
发帖数: 379 | 19 可以做ms，如果你害怕同位素的话。或者用s/t磷酸化抗体去检测，不过这个不如ms和
同位素来得有说服力。除非你能做出特异磷酸化位点的抗体那也可以了。 |
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l*******k
发帖数: 361 | 20 不同的kinase有不同的Motif,查一下就知道了，我想在网上应该有相应的软件
发信人: timememory (光阴的故事), 信区: Biology
标 题: 已知磷酸化位点,能不能推断是什么酶的底物?
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Apr 25 11:58:16 2010, 美东)
我在http://www.phosphosite.org网站上查到蛋白磷酸化的位点(多数是核磁测出来的),比如"MANRGPayGLSREVQ"中的y,能不能从这片段就推断出它是什么酶的底物?这方面完全不懂,不知道靠谱么? |
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I*****y
发帖数: 6402 | 21 看你的磷酸化位点所在的amino acid sequence，看看是不是某些kinase的preference
site,然后试kinase inhibitors，挨个试 |
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c******y
发帖数: 148 | 22 不知道你研究的是什么物种，如果是拟南芥的话，我最近琢磨着在各种激酶，磷酸酶突
变体中研究其磷酸化的变化。当然，要结合该蛋白抗体和IEF。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 23 你举的这个例子貌似不太符合我的要求，虽然 Cyclin CTK2P磷酸化后迅速降解，
但是文章里好像没有说它的磷酸化对它的活性有什么影响。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 24 BRCA1 那个是怎么样的？能不能讲讲？
Rb是哪一个Rb? retinoblastoma? 如果是这个的话那么其实是和我说的意思正好相反了。因为retinoblastoma的磷酸化会使得它失去结合E2F的活性。而我希望找一个
磷酸化后获得活性的例子。 |
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t**d
发帖数: 52 | 25 请教各位，检测蛋白磷酸化一般都用WB或IP,但我想在活细胞内观察到靶蛋白的磷酸化
，有什么办法呢？先谢过了 |
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w**********0
发帖数: 46 | 26 请问WB检测某蛋白磷酸化，能用house keeping gene做内参照么？
还是必须用该蛋白总的量：磷酸化＋未磷酸化做参照啊。
谢谢了， |
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g*********5
发帖数: 2533 | 27 1.大量磷酸化motif..
你先比较下同源蛋白，做个clustalw
先研究保守的。
2.L truncate form，看那一段和E结合。磷酸化位点应该在结合的那段上
pulse chase (fluore or isotope)， fluore如何做？谢谢。 |
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k******0
发帖数: 1073 | 28 到底线粒体有没有蛋白质磷酸化，好像有几个线粒体磷酸化的蛋白质组学研究，但好像
都没有solid的生物学功能发现。 |
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s**c
发帖数: 77 | 29 蛋白磷酸化对蛋白定位会有影响的，酿酒酵母中NCR途径和CCR途径中的一些蛋白，就是
通过磷酸化控制核-胞质定位，进行调控的，比如SRP1和GLN3。 |
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f*****f
发帖数: 195 | 30 大部分磷酸化是不会影响大体上的定位的。当然，因为定位本身是高度动态的，比如中
期磷酸化影响其在微管上的loading速度等等，单纯看可能发现不了变化。 |
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f*****f
发帖数: 195 | 31 嗯，我没说不影响，磷酸化影响定位的paper无数，但相对于总体被鉴定的磷酸化位点
数而言只占很少一部分，即使beta-catenin而言位点也很多也不是都影响定位。不过假
如一个位点影响定位，有phenotype，后面的工作开展更顺利些。 |
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p*****p
发帖数: 19331 | 32 in vivo labeling不麻烦，而且很便宜
关键是你实验室要有license,用磷32，能够看整体磷酸化水平。
phos-tag我接触过，光跑胶难度就不小，厂家的protocal都在变化。最后能达到的最理
想效果就是接近in vivo labeling的能力。
in vivo label之后，sample可以做磷酸化氨基酸分析，你就能知道是哪一种氨基酸磷
酸化了。然后可以用trypsin消化label的样品，做2D mapping......不过这一套做下来
也很费工夫。
搞research就是很费工夫。没有办法，光想没有用。
你还是先要免费抗体好了，要到几个是几个。打电话给这些公司，准备好fedex帐户，
大多数公司会免费送你一点，足够你做几次western的，但是肯定不会free shipping给
你。 |
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W*********n
发帖数: 775 | 33 现在用kinasephos2 软件预测蛋白上的磷酸化位点，但是一个研究的很清楚的蛋白上的
已经确定的两个磷酸化位点（T）都不能够预测出来，所以觉得这个软件可能不是很好
，哪位能推荐几个好用的？ 谢谢！ |
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m******u
发帖数: 12400 | 34 问题不但有点多，还问得不清楚。
我也不懂，就知道“想用inhibitor处理植物抑制磷酸化”---有许多kinase抑制剂，但
不知你问得是不是kinase抑制剂。你如果你问的不是抑制蛋白磷酸化的，那我只有说不
知道了。
应该没有抑制mRNA降解的inhibitor，但有抑制RNase的东东叫RNasin，不知是不是你想
问的。 |
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r******k
发帖数: 446 | 35 大神们 小弟最近想把证明蛋白A是B的protein phosphatase。 想建立一个in vitro的
assay 去证明。 把A和B mix 在一个tube 然后加一个可以使得B磷酸化的kinase。现在
知道可能EGF可以特异性的使得B 在某个位点磷酸化。 我能否把他们三个混在一起？
有哪位大神做过吗？ 有具体的protocol吗？ thaaaaaanks！！ |
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s*********y
发帖数: 292 | 36 至少买过30个磷酸化抗体。牛奶和BSA都用过，一般都没啥问题
碰到过一个磷酸化抗体可以和结合牛奶里面的蛋白，杂出来一张黑膜。这种情况下只能
用BSA |
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r******k
发帖数: 446 | 37 我用一张膜 先blot 磷酸化的蛋白 再blot total蛋白 发现磷酸化的比total的稍微低
一点点。 大家有遇见过这种情况吗？？？ |
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r******k
发帖数: 446 | 38 我现在也说不清楚 就是磷酸化的 不管用p-tyr去blot还是用单独位点的磷酸化抗体去
blot 都要比total蛋白的位置低一点点。。。 |
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r******k
发帖数: 446 | 39 我现在也说不清楚 就是磷酸化的 不管用p-tyr去blot还是用单独位点的磷酸化抗体去
blot 都要比total蛋白的位置低一点点。。。 |
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r******k
发帖数: 446 | 40 我晕 这么讲究。。。 我有的时候用有phos-stop和 protease inhibitor的pbs洗，有
的时候就是用普通的ice cold pbs洗。 然后加lysis buffer，还超声。。。。。。。
。。 感觉要是有的还是有 要是没有怎么都没有。。。嘻嘻
而且楼主做磷酸化不用BCA定量吗？ 其实我觉得磷酸化没那么容易就去掉，不然大家干
嘛还要有lambada phosphotase去磷酸化做control呢 |
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r******k
发帖数: 446 | 41 用facs看磷酸化 主要先看你这抗体好不好用。 如果好用 我觉得还是比western好 起
码省时间。但是如果你的蛋白的磷酸化跟cell adhension什么的相关 那就不好了 你把
细胞一typsinize signaling就会改变。 |
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发帖数: 1 | 42 我做的一个蛋白质，检测他的总蛋白的时候分布于整个细胞，而用该蛋白的磷酸化抗体
检测的时候发现磷酸化的他特异定位于核外。这个怎么解释 |
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Z******5
发帖数: 435 | 43 首先要搞清楚事实如此，还是免疫荧光的假象。用磷酸化的抗体，说不定你改个透膜条
件，核里又能染色了。 最好分离一下胞浆胞核蛋白，跑个western确认一下。
另一个方面，确实很多蛋白的核定位是受磷酸化调控的。如果western证实了你的结果
，还是值得往下挖一下的。 |
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p*****n
发帖数: 981 | 44 ☆─────────────────────────────────────☆
raison () 于 (Fri Jan 26 00:39:22 2007) 提到:
已知一个kinase phosphorylates 一个phosphatase,有什莫简单办法找到磷酸化位点呢
？多些各位
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nontypical (金属) 于 (Fri Jan 26 00:49:00 2007) 提到:
MS or point mutation
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raison () 于 (Fri Jan 26 00:50:28 2007) 提到:
MS? how?
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IVYtony (村委书记) 于 (Fri Jan 26 00:51:34 2007) 提到:
Mass Spec就是有这个应用，你还是去读一下MS手册
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a********k
发帖数: 2273 | 45 是不是只有放射性标记ATP然后体外加纯化的蛋白和PKA这一个决定性实验啊？
基本没做过生化，要证明这样一个磷酸化位点从零开始要多久啊？
谢谢了 |
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a********k
发帖数: 2273 | 46 多谢。。。我还不知道这个位点是否可以磷酸化，估计没可能要钱去做个特意抗体吧。
不过其实钱不是问题，关键是怎么快点搞出结果。
可不可以转染细胞，然后抑制或者激活PKA，然后purify我的蛋白去MS？
thanks. |
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s******e
发帖数: 1073 | 48 大肠杆菌表达异体蛋白，想知道蛋白是否可能被磷酸化修饰？谢谢！ |
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s******e
发帖数: 1073 | 49 一般磷酸化会影响蛋白的电泳结果吗？我的蛋白电泳条带有些模糊。分子量大约为 21
KD.Thanks a lot! |
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s******e
发帖数: 1073 | 50 I got the following from the web, does these mean no specific
phosphorylation or no phosphorylation at all?
"在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵
体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。" |
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