r******t
发帖数: 629 | 1 我用agilent的Site-Directed Mutagenesis Kit在蛋白的N端加6 his tag。
分两步加的，一次加三个，结果第一次三个加得很容易，第二次的三个就是加不上，
primer也是靠agilent自己网上的primer design做的。
不知道有啥办法吗？
目前好郁闷啊。
另外，有没有人试过用3个his的tag来纯化呢？ |
s********n
发帖数: 2939 | 2 为什么不直接加6xHis （18bp）？
【在 r******t 的大作中提到】
: 我用agilent的Site-Directed Mutagenesis Kit在蛋白的N端加6 his tag。
: 分两步加的，一次加三个，结果第一次三个加得很容易，第二次的三个就是加不上，
: primer也是靠agilent自己网上的primer design做的。
: 不知道有啥办法吗？
: 目前好郁闷啊。
: 另外，有没有人试过用3个his的tag来纯化呢？
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r******t
发帖数: 629 | 3 试过了，加不上
叹气。
【在 s********n 的大作中提到】
: 为什么不直接加6xHis （18bp）？
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L*****t
发帖数: 56 | 4 直接把片段切出来，用引物加一个6xHis然后重新克隆比点突变快多了，出问题的可能
性也小。
如果是一个很长的片段怕重新连接有困难的话试试这种方法，需要高纯（HPLC/PAGE）
并5'磷酸化的引物
http://openwetware.org/wiki/%27Round-the-horn_site-directed_mut |
r******t
发帖数: 629 | 5 哦呵呵，谢谢指导。
我觉得这个round the horn也挺有意思的。
嗯，这个网站也很有趣。 |
b******y
发帖数: 627 | 6 3 His is not close to be enough for purification. At least 6 His. If you can
, 8 or 10.
5' long primer containing: overhang sequence (e.g. GGAA); cloning site (make
sure in frame); His6 ---5' of your gene, should be the way to go as
abovementioned. |
m******5
发帖数: 1383 | 7 怎么可能6his加不上？引物应该有问题，我1xflag2xha8glycine 都是一次性在引物上
加的
【在 L*****t 的大作中提到】
: 直接把片段切出来，用引物加一个6xHis然后重新克隆比点突变快多了，出问题的可能
: 性也小。
: 如果是一个很长的片段怕重新连接有困难的话试试这种方法，需要高纯（HPLC/PAGE）
: 并5'磷酸化的引物
: http://openwetware.org/wiki/%27Round-the-horn_site-directed_mut
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b******y
发帖数: 627 | 8 He/she is doing mutagenesis. |
s******y
发帖数: 28562 | 9 3个不可以，最短必须要四个。
另外，如果你非要用site directed mutagenesis 的话，最好不要用完全一样的
his codon.
【在 r******t 的大作中提到】
: 我用agilent的Site-Directed Mutagenesis Kit在蛋白的N端加6 his tag。
: 分两步加的，一次加三个，结果第一次三个加得很容易，第二次的三个就是加不上，
: primer也是靠agilent自己网上的primer design做的。
: 不知道有啥办法吗？
: 目前好郁闷啊。
: 另外，有没有人试过用3个his的tag来纯化呢？
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