a******1
发帖数: 116 | 1 我转染了eGFP-actin 到HL60细胞系，在荧光下观察转染效率大概是40％－50％，用
western检测的时候：GFP的抗体可以在70kD左右检测到GFP-actin的条带；但是actin的
抗体没有70kD的条带，只有自身的43KD的条带； 请问有人碰到过类似的情况么？有什
么解决方法呀？多谢
另，已换了两个公司的actin的抗体，都只得到一条带 |
w***a
发帖数: 1053 | |
a******1
发帖数: 116 | 3 actin的抗体识别C端11个AA，这样也会么
【在 w***a 的大作中提到】
: 抗体识别位点被gfp掩盖了？？
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s******y
发帖数: 28562 | 4 很正常。
我从来还没有见过哪个actin 抗体能够识别 GFP-actin的。 我的猜想是因为
GFP 是一个很难打开的球形蛋白，所以会挡住很多抗体。
另外，actin 的N和C端距离得不远（球形蛋白）。
【在 a******1 的大作中提到】
: 我转染了eGFP-actin 到HL60细胞系，在荧光下观察转染效率大概是40％－50％，用
: western检测的时候：GFP的抗体可以在70kD左右检测到GFP-actin的条带；但是actin的
: 抗体没有70kD的条带，只有自身的43KD的条带； 请问有人碰到过类似的情况么？有什
: 么解决方法呀？多谢
: 另，已换了两个公司的actin的抗体，都只得到一条带
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w***a
发帖数: 1053 | 5 我觉得可以检测的到
如果抗体识别位点离gfp不是很近的话
你可以western的时候曝光时间长一些,看看能不能看到gfp-actin条带
【在 a******1 的大作中提到】
: actin的抗体识别C端11个AA，这样也会么
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a******1
发帖数: 116 | 6 那有什么替代方案来检测转染的gfp-actin与总的actin的比值呢？
另外，western不都是一维的了么，怎么还有球形结构；
【在 s******y 的大作中提到】
: 很正常。
: 我从来还没有见过哪个actin 抗体能够识别 GFP-actin的。 我的猜想是因为
: GFP 是一个很难打开的球形蛋白，所以会挡住很多抗体。
: 另外，actin 的N和C端距离得不远（球形蛋白）。
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a******1
发帖数: 116 | 7 长曝光确实能看到一条很弱的带，
但我主要是想看 GFP-actin/total actin的比值，这样就不准确了吧
【在 w***a 的大作中提到】
: 我觉得可以检测的到
: 如果抗体识别位点离gfp不是很近的话
: 你可以western的时候曝光时间长一些,看看能不能看到gfp-actin条带
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s******y
发帖数: 28562 | 8 SDS 其实没有大家想的那么厉害
【在 a******1 的大作中提到】
: 那有什么替代方案来检测转染的gfp-actin与总的actin的比值呢？
: 另外，western不都是一维的了么，怎么还有球形结构；
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a******1
发帖数: 116 | 9 那咋个办呢。。。
【在 s******y 的大作中提到】
: SDS 其实没有大家想的那么厉害
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w***a
发帖数: 1053 | 10 比值是相对的
内源性actin是很多的
搞不懂你一种条件下看比值什么用 |
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s******y
发帖数: 28562 | 11 如果你一定要做的话，可以用GFP抗体把 GFP-actin 拉下来，然后用anti-actin 把
actin 拉下来，然后跑胶对比
【在 a******1 的大作中提到】
: 那咋个办呢。。。
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s******y
发帖数: 28562 | 12 如果你一定要做的话，可以用GFP抗体把 GFP-actin 拉下来，然后用anti-actin 把
actin 拉下来，然后跑胶对比
【在 a******1 的大作中提到】
: 那咋个办呢。。。
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w***a
发帖数: 1053 | 13 抗体不同,pull down的能力也不同
就算都pull down下来考染,看深浅的比值也未必精确
如果是相对的,几个条件的转染,就跑western就行了,把sample稀释一下然后把几个条件
的actin条带调平,然后最大限度load原sample看gfp-actin
【在 s******y 的大作中提到】
: 如果你一定要做的话，可以用GFP抗体把 GFP-actin 拉下来，然后用anti-actin 把
: actin 拉下来，然后跑胶对比
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s******y
发帖数: 28562 | 14 问题是你用actin antibody 看到的那个70kD带未必是真的GFP-actin
【在 w***a 的大作中提到】
: 抗体不同,pull down的能力也不同
: 就算都pull down下来考染,看深浅的比值也未必精确
: 如果是相对的,几个条件的转染,就跑western就行了,把sample稀释一下然后把几个条件
: 的actin条带调平,然后最大限度load原sample看gfp-actin
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w***a
发帖数: 1053 | 15 我觉得那就是真的
actin这种蛋白细胞里太多了
远远大于外源性的
如果western把内源性的actin调节的很漂亮的一条带
这时候外源性的很难看到
【在 s******y 的大作中提到】
: 问题是你用actin antibody 看到的那个70kD带未必是真的GFP-actin
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a******1
发帖数: 116 | 16 我转染的GFP-actin是有点突变的，转染了之后用细胞做了跟actin有关的其他实验；所
以得看比值
【在 w***a 的大作中提到】
: 比值是相对的
: 内源性actin是很多的
: 搞不懂你一种条件下看比值什么用
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a******1
发帖数: 116 | 17 我觉得应该是真的，绿色荧光看得很好，而且western的背景也比较干净，条带也比较
清楚
【在 s******y 的大作中提到】
: 问题是你用actin antibody 看到的那个70kD带未必是真的GFP-actin
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s******y
发帖数: 28562 | 18 你是说长暴光的时候看到那个弱带的时候背景很干净么？
我以前试图过类似事情，但是发现那个弱带的信号比实际的蛋白的量少。就是说，
虽然看起来非常少，但是真实的量似乎没有那么少。
【在 a******1 的大作中提到】
: 我觉得应该是真的，绿色荧光看得很好，而且western的背景也比较干净，条带也比较
: 清楚
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s******y
发帖数: 28562 | 19 你是说长暴光的时候看到那个弱带的时候背景很干净么？
我以前试图过类似事情，但是发现那个弱带的信号比实际的蛋白的量少。就是说，
虽然看起来非常少，但是真实的量似乎没有那么少。
【在 a******1 的大作中提到】
: 我觉得应该是真的，绿色荧光看得很好，而且western的背景也比较干净，条带也比较
: 清楚
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a******1
发帖数: 116 | 20 这个想法值得一试，哈哈，多谢；
本来想的是同时用不同浓度的actin和GFP蛋白来做一个梯度，再加上我的samples，分
别用anti-actin和anti-GFP,最后婉转的得出个比值。。。
【在 w***a 的大作中提到】
: 抗体不同,pull down的能力也不同
: 就算都pull down下来考染,看深浅的比值也未必精确
: 如果是相对的,几个条件的转染,就跑western就行了,把sample稀释一下然后把几个条件
: 的actin条带调平,然后最大限度load原sample看gfp-actin
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a******1
发帖数: 116 | 21 anti-GFP,anti-actin的背景都还可以的；我知道长曝光这样就算得出个比值也没有意
义，所以要另想他法呀
多谢~
【在 s******y 的大作中提到】
: 你是说长暴光的时候看到那个弱带的时候背景很干净么？
: 我以前试图过类似事情，但是发现那个弱带的信号比实际的蛋白的量少。就是说，
: 虽然看起来非常少，但是真实的量似乎没有那么少。
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s******r
发帖数: 2876 | 22 不能用其他tag吗？
或者用GFP-Actin + other tag的construct.
【在 a******1 的大作中提到】
: 我转染了eGFP-actin 到HL60细胞系，在荧光下观察转染效率大概是40％－50％，用
: western检测的时候：GFP的抗体可以在70kD左右检测到GFP-actin的条带；但是actin的
: 抗体没有70kD的条带，只有自身的43KD的条带； 请问有人碰到过类似的情况么？有什
: 么解决方法呀？多谢
: 另，已换了两个公司的actin的抗体，都只得到一条带
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a******1
发帖数: 116 | 23 没太看明白，而且有deadline，赶不急换了
【在 s******r 的大作中提到】
: 不能用其他tag吗？
: 或者用GFP-Actin + other tag的construct.
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i***l
发帖数: 1656 | 24 你这样设计已经不准确了 因为Actin抗体和Actin，GFP Actin的结合强度不一样 你怎
么基于这个比值看蛋白Ratio？
【在 a******1 的大作中提到】
: 长曝光确实能看到一条很弱的带，
: 但我主要是想看 GFP-actin/total actin的比值，这样就不准确了吧
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s******y
发帖数: 28562 | 25 如果你要认真做的话，应该这么做：
用anti-GFP 来pulldown GFP-actin, 或者直接在细菌里表达GFP (or GFP-actin, 没有
活性没关系，反正是用来western), 或者直接到公司买点GFP standard protein
sample.
然后先跑胶用蓝染或者银染，对照已知浓度的BSA 来测定浓度，然后用这个GFP (or
GFP-actin)来作为标准浓度来对比你的细胞里面的GFP-actin来估算浓度。
【在 a******1 的大作中提到】
: anti-GFP,anti-actin的背景都还可以的；我知道长曝光这样就算得出个比值也没有意
: 义，所以要另想他法呀
: 多谢~
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c********b
发帖数: 363 | 26 可不可以在GFP和actin之间放一个3c protease的site，比较切或者不切情况下actin的
强度（都normalize到GAPDH）变化。
【在 a******1 的大作中提到】
: 我转染了eGFP-actin 到HL60细胞系，在荧光下观察转染效率大概是40％－50％，用
: western检测的时候：GFP的抗体可以在70kD左右检测到GFP-actin的条带；但是actin的
: 抗体没有70kD的条带，只有自身的43KD的条带； 请问有人碰到过类似的情况么？有什
: 么解决方法呀？多谢
: 另，已换了两个公司的actin的抗体，都只得到一条带
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k****o
发帖数: 589 | 27 像楼上说的，tag和actin之间加段短的酶切位点。
你的actin抗体显然不适合直接pulldown GFP-actin融合蛋白。 |
k******0
发帖数: 1073 | 28 您的试验说明了：
1。 GFP抗体优于actin的抗体。同样的蛋白量，GFP抗体可以轻易监测到，而用actin抗
体比较费劲测定。
2。内源的actin表达量远高于GFP－actin的表达量。所以用actin抗体可以容易检测到
43kDa
的蛋白带，而较难检测到70kDa的带。
即使尝试其它办法，可能也是得出同样的结论。
【在 a******1 的大作中提到】
: 我转染了eGFP-actin 到HL60细胞系，在荧光下观察转染效率大概是40％－50％，用
: western检测的时候：GFP的抗体可以在70kD左右检测到GFP-actin的条带；但是actin的
: 抗体没有70kD的条带，只有自身的43KD的条带； 请问有人碰到过类似的情况么？有什
: 么解决方法呀？多谢
: 另，已换了两个公司的actin的抗体，都只得到一条带
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a******1
发帖数: 116 | 29 对的，我正在打算买GFP来做；多谢
【在 s******y 的大作中提到】
: 如果你要认真做的话，应该这么做：
: 用anti-GFP 来pulldown GFP-actin, 或者直接在细菌里表达GFP (or GFP-actin, 没有
: 活性没关系，反正是用来western), 或者直接到公司买点GFP standard protein
: sample.
: 然后先跑胶用蓝染或者银染，对照已知浓度的BSA 来测定浓度，然后用这个GFP (or
: GFP-actin)来作为标准浓度来对比你的细胞里面的GFP-actin来估算浓度。
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