s******l
发帖数: 7 | 1 ITC 可以用来检测蛋白之间的相互作用，计算出结合常数，但是我的两个蛋白之间会发
生反应，就是酶和作用底物，酶会降解作用底物，但是我又想测量酶和底物的结合常数
，不知道 ITC 能不能用，或是有什么其他的方法。请大家不吝赐教！谢谢！ |
p*****u
发帖数: 276 | 2 itc能否用，还要看你的结合常数大小，如果结合常数太弱就不行，还有你的蛋白质浓
度也很重要，还要保证蛋白质不变性，另外滴定的那个ligand不能太粘否则剂量就不准
了。你的这个情况基本不能用itc，可以考虑spr（表面质子共振），快速便宜还方便。
就是在chip上连接你的蛋白质，然后看激光的折射率变化，如果有binding那折射率就
变化了，根据变化可以计算出结合常数。 |
p*****u
发帖数: 276 | 3 也许也能用itc，不过可能要费些事儿，因为你要满足itc的s曲线的种种苛刻要求。 |
b******y
发帖数: 627 | 4 If binding is much faster than enzymatic activity, you can. However, it
normally takes up to a few hours to finish an ITC experiments. Not a whole
lot of enzymes are that lousy.
To do it right, you have to make an inactive mutant that doesn't perturb
substrate binding.
In M-M curve analysis, you can back up a term, Km, which is close to an
apparent KD. |
i***0
发帖数: 160 | |
V**3
发帖数: 12756 | 6 最关键你的结合必须有热效应
有些结合时没有热效应的
可以用dead mutant做，但是这个方法不是现在流行的
【在 s******l 的大作中提到】
: ITC 可以用来检测蛋白之间的相互作用，计算出结合常数，但是我的两个蛋白之间会发
: 生反应，就是酶和作用底物，酶会降解作用底物，但是我又想测量酶和底物的结合常数
: ，不知道 ITC 能不能用，或是有什么其他的方法。请大家不吝赐教！谢谢！
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p*****u
发帖数: 191 | 7 如果没有热效应，怎么会自发结合？随机碰撞吗？
用结合的热来克服熵值或者去溶剂能，然后最后也没有热效应，值得做不？
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对于酶反应最好不要用itc，但是，ITC可以做。并且可以求得Km Kcat deltaH.
仅仅用Km不知道能不能满足你的需要
【在 V**3 的大作中提到】
: 最关键你的结合必须有热效应
: 有些结合时没有热效应的
: 可以用dead mutant做，但是这个方法不是现在流行的
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