V***b
发帖数: 3419 | 1 现在要比较一下在两个细胞里的proteasome活性，这两个细胞太不一样了，proteasome
, lysosome，autophagy的水平都不一样。所以要单纯比较proteasome活性的差异不能
看global protein turn-over。我想到的是观察完全依赖proteasome降解的蛋白，谁能
介绍几个，谢谢。或者有其他的什么手段更好的测定proteasome活性？ |
a*****u
发帖数: 802 | 2 proteasome substrates太多了，经典的有p53, cyclinB, HIF1a, HMG CoA reductase2
, Insig1 (忘了是1还是2）。
proteasome有3个active centers建议最直接的方法就是纯化proteasome，用产荧光的
substrates检测其活性。或者简单的用model substrates，其中一个是ub-GFP |
m******5
发帖数: 1383 | 3 纯化proteasome不简单吧？大多数时候都是把20s搞出来然后丢掉19s
reductase2
【在 a*****u 的大作中提到】
: proteasome substrates太多了，经典的有p53, cyclinB, HIF1a, HMG CoA reductase2
: , Insig1 (忘了是1还是2）。
: proteasome有3个active centers建议最直接的方法就是纯化proteasome，用产荧光的
: substrates检测其活性。或者简单的用model substrates，其中一个是ub-GFP
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a*****u
发帖数: 802 | 4 提proteasome还好，简单的话有人在某个subunit上加了tag，IP就是了。想纯，没有
modification的话要过好几个柱子。以前rotation的时候做过，很麻烦而且需要很多细
胞。
确实，这个问题本身就很复杂，proteasome活性又受19s的影响。 |
m******5
发帖数: 1383 | 5 恩，不知道有没有卖细胞系和老鼠的，我记得那个加tag的是酵母最早？
【在 a*****u 的大作中提到】
: 提proteasome还好，简单的话有人在某个subunit上加了tag，IP就是了。想纯，没有
: modification的话要过好几个柱子。以前rotation的时候做过，很麻烦而且需要很多细
: 胞。
: 确实，这个问题本身就很复杂，proteasome活性又受19s的影响。
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m******5
发帖数: 1383 | 6 不过我叫得LZ的问题没那么复杂吧？
能不能就做个蔗糖梯度然后取26S组分做荧光底物以及泡脚看pattern?
不用走柱子了吧
【在 a*****u 的大作中提到】
: 提proteasome还好，简单的话有人在某个subunit上加了tag，IP就是了。想纯，没有
: modification的话要过好几个柱子。以前rotation的时候做过，很麻烦而且需要很多细
: 胞。
: 确实，这个问题本身就很复杂，proteasome活性又受19s的影响。
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V***b
发帖数: 3419 | 7 多谢楼上几位。纯化proteasome我看还是尽量避免，因为即便是粗提也不见得可以把
lysesome和autophagosome分出去，而且整个的26S也很难保证完整性，最后问题就复杂
化了。还是飞侠说的model substrates来的直接。 |
s******y
发帖数: 28562 | 8 ub-GFP 只能作为参考。因为Ubiquitin 和proteasome 其实不是严格
的紧密联系关系。
如果只是一个支持数据，那么ub-GFP 可以用，
如果是非常重要的结果，那么必须用其他方法来重复这个实验。
【在 V***b 的大作中提到】
: 多谢楼上几位。纯化proteasome我看还是尽量避免，因为即便是粗提也不见得可以把
: lysesome和autophagosome分出去，而且整个的26S也很难保证完整性，最后问题就复杂
: 化了。还是飞侠说的model substrates来的直接。
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V***b
发帖数: 3419 | 9 嗯，是这样。ub-substrate在降解前还要de-ub，所以de-ub的效率也影响proteasome降
解该底物的速度，而且de-ub的酶还很多，针对每个底物还不一样。我想的是最简单的
方法用cell lysate，然后把ub-GFP丢进去，温育一段时间，然后看看底物省多少。如
果ub-GFP加速降解，我至少可以说UPS在这个细胞里活性增强了。不过感觉挺弱的。
我现在正在搞35S pulse-chase看global protein turn-over，但这个细胞的autophagy
和lysesome都变了，试验结果不容易阐述啊。。。就怕reviewer到最后猛踩我一脚，我
就无法翻身了。
【在 s******y 的大作中提到】
: ub-GFP 只能作为参考。因为Ubiquitin 和proteasome 其实不是严格
: 的紧密联系关系。
: 如果只是一个支持数据，那么ub-GFP 可以用，
: 如果是非常重要的结果，那么必须用其他方法来重复这个实验。
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r*****t
发帖数: 4793 | 10 这个怎么样？
Cell-Based Proteasome-Glo™ Assays |
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s******y
发帖数: 28562 | 11 用来测proteaasome activity 的 ub-GFP必须是那种不能被cleave 的ub，
否则表达过程中就被抢先cleaved 了。
所以这个de-ub 不是一个问题。
成问题的主要原因是因为ubiquitinylated protein 也能成为lysosome,
autophagosome的底物，所以不是那么的特异。
如果这个问题对你们非常重要的话，我建议你用三种方法来重复：
1. uncleavable ub-GFP
2. P53 or H1f, by using cycloheximide or pulse trace
3. partially purified proteasome with artificial substrate
然后再加上一个加beta-lactone 的逆对照
autophagy
【在 V***b 的大作中提到】
: 嗯，是这样。ub-substrate在降解前还要de-ub，所以de-ub的效率也影响proteasome降
: 解该底物的速度，而且de-ub的酶还很多，针对每个底物还不一样。我想的是最简单的
: 方法用cell lysate，然后把ub-GFP丢进去，温育一段时间，然后看看底物省多少。如
: 果ub-GFP加速降解，我至少可以说UPS在这个细胞里活性增强了。不过感觉挺弱的。
: 我现在正在搞35S pulse-chase看global protein turn-over，但这个细胞的autophagy
: 和lysesome都变了，试验结果不容易阐述啊。。。就怕reviewer到最后猛踩我一脚，我
: 就无法翻身了。
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e***y
发帖数: 358 | |
V***b
发帖数: 3419 | 13 多谢指点，思路开阔了些。
【在 s******y 的大作中提到】
: 用来测proteaasome activity 的 ub-GFP必须是那种不能被cleave 的ub，
: 否则表达过程中就被抢先cleaved 了。
: 所以这个de-ub 不是一个问题。
: 成问题的主要原因是因为ubiquitinylated protein 也能成为lysosome,
: autophagosome的底物，所以不是那么的特异。
: 如果这个问题对你们非常重要的话，我建议你用三种方法来重复：
: 1. uncleavable ub-GFP
: 2. P53 or H1f, by using cycloheximide or pulse trace
: 3. partially purified proteasome with artificial substrate
: 然后再加上一个加beta-lactone 的逆对照
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V***b
发帖数: 3419 | 14 看上去不错。10毫升一千多刀，成本几块钱吧。买来试试。
【在 r*****t 的大作中提到】
: 这个怎么样？
: Cell-Based Proteasome-Glo™ Assays
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l**********1
发帖数: 5204 | 15 plus
avoid autocatalytic N terminal or C terminal Ubiquitin/proteasome-GFP
otherwise no positive results from autocatalysis happened.
please refer:
N terminal autocatalytic Ubiquitin/proteasome
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22183254
Proteasomes and protein conjugation across domains of life
(2011)
>These active sites are exposed after autocatalytic removal of N-terminal ...
>site
or
C terminal autocatalytic Ubiquitin/proteasome
HTTPS://www.uni-hohenheim.de/www260/pdf/planta220.pdf
【在 s******y 的大作中提到】
: 用来测proteaasome activity 的 ub-GFP必须是那种不能被cleave 的ub，
: 否则表达过程中就被抢先cleaved 了。
: 所以这个de-ub 不是一个问题。
: 成问题的主要原因是因为ubiquitinylated protein 也能成为lysosome,
: autophagosome的底物，所以不是那么的特异。
: 如果这个问题对你们非常重要的话，我建议你用三种方法来重复：
: 1. uncleavable ub-GFP
: 2. P53 or H1f, by using cycloheximide or pulse trace
: 3. partially purified proteasome with artificial substrate
: 然后再加上一个加beta-lactone 的逆对照
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a*****u
发帖数: 802 | 16 问楼主一个问题，如果2个细胞很不一样，我假设genetic background都不一样，那对
比proteasome活性有什么意义呢？因为除了proteasome，估计其他的生理活性也有很大
不同。
回到问题本身，感觉还是用Cell-Based Proteasome-Glo™ Assays这个kit好些，
因为最直接。用底物都是indirect的方法，而且底物的降解，在proteasome上游还受E1
,E2,E3 adaptor，regulatory partical 一系列cascade的影响，中间那个环节变了，
底物的降解也随之受影响。 |
V***b
发帖数: 3419 | 17 genetic background是一样的，就是敲掉了个抑癌基因，结果好多生理功能都变了。
你说的对，我也觉得这个kit不错，受其他影响因素少。
E1
【在 a*****u 的大作中提到】
: 问楼主一个问题，如果2个细胞很不一样，我假设genetic background都不一样，那对
: 比proteasome活性有什么意义呢？因为除了proteasome，估计其他的生理活性也有很大
: 不同。
: 回到问题本身，感觉还是用Cell-Based Proteasome-Glo™ Assays这个kit好些，
: 因为最直接。用底物都是indirect的方法，而且底物的降解，在proteasome上游还受E1
: ,E2,E3 adaptor，regulatory partical 一系列cascade的影响，中间那个环节变了，
: 底物的降解也随之受影响。
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