b****r
发帖数: 17995 | 1 刚才有人发个western，用MG132，一个蛋白量不变，用cycloheximide蛋白量反而明显
增加，与大部分蛋白正相反，正要回答结果删贴了，还是把我的想法打出来看看大家的
看法
依稀中好像看到过这样的情况
我现在的想法是是不是这个蛋白主要不通过proteasome降解所以MG132无效，而这个蛋
白在你处理之前就已经合成了不少，而它的降解是通过 一种 fast turnover的蛋白酶
进行，所以用cycloheximide反而造成其量增加 |
s******y
发帖数: 28562 | 2 这是一个可能性。
但是还有另外一个可能性就是他们添加cycloheximide的时候不是直接加入原有的培养
液中，而是新配了一个含有cycloheximide的培养液然后给细胞换液，这个就会导致细
胞在30分钟到一个小时之内会出现蛋白上升的现象。这个是很多不专门做蛋白降解的实
验室都会出现的操作错误。
【在 b****r 的大作中提到】
: 刚才有人发个western，用MG132，一个蛋白量不变，用cycloheximide蛋白量反而明显
: 增加，与大部分蛋白正相反，正要回答结果删贴了，还是把我的想法打出来看看大家的
: 看法
: 依稀中好像看到过这样的情况
: 我现在的想法是是不是这个蛋白主要不通过proteasome降解所以MG132无效，而这个蛋
: 白在你处理之前就已经合成了不少，而它的降解是通过 一种 fast turnover的蛋白酶
: 进行，所以用cycloheximide反而造成其量增加
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p****s
发帖数: 3153 | 3 感觉逻辑很对呀
【在 b****r 的大作中提到】
: 刚才有人发个western，用MG132，一个蛋白量不变，用cycloheximide蛋白量反而明显
: 增加，与大部分蛋白正相反，正要回答结果删贴了，还是把我的想法打出来看看大家的
: 看法
: 依稀中好像看到过这样的情况
: 我现在的想法是是不是这个蛋白主要不通过proteasome降解所以MG132无效，而这个蛋
: 白在你处理之前就已经合成了不少，而它的降解是通过 一种 fast turnover的蛋白酶
: 进行，所以用cycloheximide反而造成其量增加
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p****s
发帖数: 3153 | 4 为啥头30分钟到一个小时蛋白会上升呢
【在 s******y 的大作中提到】
: 这是一个可能性。
: 但是还有另外一个可能性就是他们添加cycloheximide的时候不是直接加入原有的培养
: 液中，而是新配了一个含有cycloheximide的培养液然后给细胞换液，这个就会导致细
: 胞在30分钟到一个小时之内会出现蛋白上升的现象。这个是很多不专门做蛋白降解的实
: 验室都会出现的操作错误。
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g******o
发帖数: 96 | 5 如果加入MG132，一个蛋白在WT细胞中积累，在KO（另一个调节蛋白KO cell line）细
胞中反而降低，该如何解释呢？ |
b****r
发帖数: 17995 | 6 那这种错误还是稍微有点不应该啊
加药物的时候control要一模一样的处理，换液就都换液，加药的响应对照还得有
vehicle，这个是基本常识啊
【在 s******y 的大作中提到】
: 这是一个可能性。
: 但是还有另外一个可能性就是他们添加cycloheximide的时候不是直接加入原有的培养
: 液中，而是新配了一个含有cycloheximide的培养液然后给细胞换液，这个就会导致细
: 胞在30分钟到一个小时之内会出现蛋白上升的现象。这个是很多不专门做蛋白降解的实
: 验室都会出现的操作错误。
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b****r
发帖数: 17995 | 7 不加MG132什么表现
【在 g******o 的大作中提到】
: 如果加入MG132，一个蛋白在WT细胞中积累，在KO（另一个调节蛋白KO cell line）细
: 胞中反而降低，该如何解释呢？
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s******y
发帖数: 28562 | 8 这个你误会我的意思了。我的意思是，凡是要加cycloheximide 的实验，都不应该在当
时换液，和是否有control 无关。因为换上新的培养液的pH值，各种养分成分以及生长
因子的浓度都不一样，会刺激细胞大量制造蛋白的。但是因为cycloheximide 生效需要
至少30分钟，所以在这段时间里面细胞里的蛋白会突然变高，然后一个小时之后才会在
cycloheximide的作用下重新变低。
所以正确做法是应该在前一天提前换好新的培养液，即使实在要当天换液的话也必须提
前3个小时以上。然后，加cycloheximide的时候应该直接加到现有的培养液里去。但是
如果细胞不是养在平底皿里或者因为其他原因如果怕掌握不好的话，可以把原有的细胞
液吸出一半来，在外面把药品加了，然后再转移回去。
如果实在是没有办法，一定要加新培养液的话，那么在我的经验里，只要不超过20%的
体积，作出来的结果还是可以容忍的。
这个事情其实大部分不专业做降解的实验室都不知道，即使是有些做蛋白降解的实验室
，如果他们的老板不注意培训学生的话也不一定会知道这个事情。
【在 b****r 的大作中提到】
: 那这种错误还是稍微有点不应该啊
: 加药物的时候control要一模一样的处理，换液就都换液，加药的响应对照还得有
: vehicle，这个是基本常识啊
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s******y
发帖数: 28562 | 9 新加入的培养液刺激细胞
【在 p****s 的大作中提到】
: 为啥头30分钟到一个小时蛋白会上升呢
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b****r
发帖数: 17995 | 10 原来如此
【在 s******y 的大作中提到】
: 这个你误会我的意思了。我的意思是，凡是要加cycloheximide 的实验，都不应该在当
: 时换液，和是否有control 无关。因为换上新的培养液的pH值，各种养分成分以及生长
: 因子的浓度都不一样，会刺激细胞大量制造蛋白的。但是因为cycloheximide 生效需要
: 至少30分钟，所以在这段时间里面细胞里的蛋白会突然变高，然后一个小时之后才会在
: cycloheximide的作用下重新变低。
: 所以正确做法是应该在前一天提前换好新的培养液，即使实在要当天换液的话也必须提
: 前3个小时以上。然后，加cycloheximide的时候应该直接加到现有的培养液里去。但是
: 如果细胞不是养在平底皿里或者因为其他原因如果怕掌握不好的话，可以把原有的细胞
: 液吸出一半来，在外面把药品加了，然后再转移回去。
: 如果实在是没有办法，一定要加新培养液的话，那么在我的经验里，只要不超过20%的
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F*K
发帖数: 608 | 11 多谢楼上各位的回复，原帖是我发的。删了是因为我想重复一下这个实验，以免得浪费
大家的时间。
的确，DMSO， MG132和cycloheximide都是配到了新的培养基里，但是我处理了20个小
时后再收的细胞，新培养基应该问题不大吧？ 谢谢！
【在 b****r 的大作中提到】
: 刚才有人发个western，用MG132，一个蛋白量不变，用cycloheximide蛋白量反而明显
: 增加，与大部分蛋白正相反，正要回答结果删贴了，还是把我的想法打出来看看大家的
: 看法
: 依稀中好像看到过这样的情况
: 我现在的想法是是不是这个蛋白主要不通过proteasome降解所以MG132无效，而这个蛋
: 白在你处理之前就已经合成了不少，而它的降解是通过 一种 fast turnover的蛋白酶
: 进行，所以用cycloheximide反而造成其量增加
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s******y
发帖数: 28562 | 12 20个小时太长了！很多正常细胞都死了，活下来的很多都是怪胎。
一般我对这种实验的处理都不超过9个小时。
另外，注意看我上面的回复，要提前一天换液。加药品处理的当天不要加新培养液。
【在 F*K 的大作中提到】
: 多谢楼上各位的回复，原帖是我发的。删了是因为我想重复一下这个实验，以免得浪费
: 大家的时间。
: 的确，DMSO， MG132和cycloheximide都是配到了新的培养基里，但是我处理了20个小
: 时后再收的细胞，新培养基应该问题不大吧？ 谢谢！
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l**********1
发帖数: 5204 | 13 Bingo bmw well said
LZ
plus one paper:
Wiggins CM et al.
BIMEL, an intrinsically disordered protein, is degraded
by 20S proteasomes in the absence of poly-ubiquitylation. (2011).
J Cell Sci. 124: 969-77.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21378313
PDF link:
//www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/dk/DK-lab/Publications_files/Wiggins-etal_
BIMELdegrad+supp.pdf
or one review
Wang Z et al.
Identification and characterization of two splicing variants of human Noxa.
(2008).
Anticancer Res. 28: 1667-74.
>The protein half-life of the two variants is
>approximately 40 to 60 mins with MG132, suggesting they are
>rapidly degraded via proteasome-dependent and independent
>pathways.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18630524
PDF link:
//ar.iiarjournals.org/content/28/3A/1667.full.pdf
>
>>
【在 F*K 的大作中提到】
: 多谢楼上各位的回复，原帖是我发的。删了是因为我想重复一下这个实验，以免得浪费
: 大家的时间。
: 的确，DMSO， MG132和cycloheximide都是配到了新的培养基里，但是我处理了20个小
: 时后再收的细胞，新培养基应该问题不大吧？ 谢谢！
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g******o
发帖数: 96 | 14 不加MG132，ko里稍微少一些。
【在 b****r 的大作中提到】
: 不加MG132什么表现
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b****r
发帖数: 17995 | 15 被KO的调节蛋白可能正好抑制 可以降解你蛋白的蛋白，负负得正
【在 g******o 的大作中提到】
: 不加MG132，ko里稍微少一些。
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c*******7
发帖数: 314 | 16 但是如果是测试药物，要测试pathway recover是否是因为新蛋白的合成，还是因为
compound失效了，那么做washout-/+CHX，这种情况不可能不换新的培养液啊
【在 s******y 的大作中提到】
: 这个你误会我的意思了。我的意思是，凡是要加cycloheximide 的实验，都不应该在当
: 时换液，和是否有control 无关。因为换上新的培养液的pH值，各种养分成分以及生长
: 因子的浓度都不一样，会刺激细胞大量制造蛋白的。但是因为cycloheximide 生效需要
: 至少30分钟，所以在这段时间里面细胞里的蛋白会突然变高，然后一个小时之后才会在
: cycloheximide的作用下重新变低。
: 所以正确做法是应该在前一天提前换好新的培养液，即使实在要当天换液的话也必须提
: 前3个小时以上。然后，加cycloheximide的时候应该直接加到现有的培养液里去。但是
: 如果细胞不是养在平底皿里或者因为其他原因如果怕掌握不好的话，可以把原有的细胞
: 液吸出一半来，在外面把药品加了，然后再转移回去。
: 如果实在是没有办法，一定要加新培养液的话，那么在我的经验里，只要不超过20%的
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r******k
发帖数: 446 | 17 Sunnyday你好！ 我看很多paper都说 是要用serum free的medium 如果要加CHX的话。
还有 我看很多文章 加药都加到了18hr。 9hr 好像看到的变化不明显呀。
非常感谢！
【在 s******y 的大作中提到】
: 20个小时太长了！很多正常细胞都死了，活下来的很多都是怪胎。
: 一般我对这种实验的处理都不超过9个小时。
: 另外，注意看我上面的回复，要提前一天换液。加药品处理的当天不要加新培养液。
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s******y
发帖数: 28562 | 18 这里应该是指用serum free 的培养液来冲调cycloheximide (usually dissolved in
DMSO), 然后再加进原有的培养液里（就是不换液）。在我的经验中这样是可以的，只
要加进去的东西不要超过总体积的20%。
至于说加药到18小时，这个就要赌运气了。在大部分情况下，我不会相信任何超过12个
小时的数据，因为细胞都开始调亡了，谁知道蛋白的变化是什么造成的啊？
对于半衰期特别长的蛋白，标准做法是用同位素标记法。
另外，再多说一句，对于半衰期特别短的蛋白，同位素标记法其实不是一个好方法（除
非是体外转录直接加到反应液体里），因为标记需要至少半个小时到一个小时，其实并
不是一个真正的instant pulse，再加上immune pulldown 本来就不是容易重复的量化
手段（实验的随机误差很大），对于短寿命的蛋白测出来的数值很不可靠。所以这个方
法只对于比较长寿命的蛋白适用。
。
【在 r******k 的大作中提到】
: Sunnyday你好！ 我看很多paper都说 是要用serum free的medium 如果要加CHX的话。
: 还有 我看很多文章 加药都加到了18hr。 9hr 好像看到的变化不明显呀。
: 非常感谢！
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r******k
发帖数: 446 | 19 Hi sunnyday
非常感谢！ 但是我看到的我们实验室的文章确实是说transfer to serum free medium
里面。 我们确实不是专门做蛋白降解的 所以不太专业哈。 小弟还有一个问题就是为
什么要用serum free的medium来溶解药物呢？ 直接加在原有的培养基里呢？
还有就是我要研究的蛋白 是一个mut的蛋白，在细胞系里面没有，必须要通过外源表达
才行。 这种overexpress的蛋白做chx的实验 是不是要增长时间点呢？ 非常感谢！
【在 s******y 的大作中提到】
: 这里应该是指用serum free 的培养液来冲调cycloheximide (usually dissolved in
: DMSO), 然后再加进原有的培养液里（就是不换液）。在我的经验中这样是可以的，只
: 要加进去的东西不要超过总体积的20%。
: 至于说加药到18小时，这个就要赌运气了。在大部分情况下，我不会相信任何超过12个
: 小时的数据，因为细胞都开始调亡了，谁知道蛋白的变化是什么造成的啊？
: 对于半衰期特别长的蛋白，标准做法是用同位素标记法。
: 另外，再多说一句，对于半衰期特别短的蛋白，同位素标记法其实不是一个好方法（除
: 非是体外转录直接加到反应液体里），因为标记需要至少半个小时到一个小时，其实并
: 不是一个真正的instant pulse，再加上immune pulldown 本来就不是容易重复的量化
: 手段（实验的随机误差很大），对于短寿命的蛋白测出来的数值很不可靠。所以这个方
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