a*******u 发帖数: 2 | 1 请问以cDNA为模板扩增8kb的一个基因是什么难度?(该基因分子量接近300kd)
还是说没有普遍性?因基因而异?
我们实验室想以人的细胞系或小鼠组织的cDNA为模板,扩增一个大约8kb的基因,导师
觉得一次扩增这么长的片段不太可能成功。确实,我们试了分段P,结果P 4000bp的其
中片段都不成功。我们用的是LA Taq。
请问对cDNA的反转录过程有什么特别要求吗?我们用了oligo和random引物,takara的
试剂盒。
另外如果买相应克隆的话要4000美元,比较不能接受。
大家遇到这种情况是怎么解决的呢? |
j****x 发帖数: 1704 | |
R******n 发帖数: 33 | 3 从基因组DNA里面分段扩exon然后拼起来 :) |
S******e 发帖数: 393 | 4 我是这样做的:从公司买的cDNA(这样可以保证质量),好像也不贵,
然后用pfu(pfu from invitrogen or NEB,记不清了,两家都用过),
扩了两个4kb,测序,然后拼接为8kb的片段。 |
c******r 发帖数: 3778 | 5 自己拼啊。
关键看你想干嘛。
如果想克隆出来慢慢玩儿,8kb,两段要是不行,分3段,4段怎么都可以了啊。不要用
random primer,用自己design几个primers也没多麻烦。顺利的话两个礼拜,不顺利一
两个月怎么也可以了。
如果需要很多samples拿来测序,一次扩也可以,但是要摸条件,RT需要调整protocol
,否则拿不到那么长的cDNA。慢慢试啦,不一定100%都可以成功,但是也不是不可能啦
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