H*********8
发帖数: 323 | 1 我这个BAC的构建方式是这样的,携带着整个A基因的BAC, 在第一个外显子处插入CRE基
因,
把本身A基因的启动子ATG突变掉, 我老板设计的时候,CRE只有STOP CODON, 但没有PLOY
A,
然后就这么插进第一个外显子里了. 我想问问这样 能不能终止cre的翻译。这样得到的
蛋白算A基因和cre的融合蛋白,还是只
表达CRE，是否影响cre的功能？
请有经验的同仁帮个忙，解答一下。 |
l**********k
发帖数: 189 | 2 我看到你前面发过一个帖子，说看不到cre表达。我说说我的理解。不知道对不对。
1）你这个方法说不上把A本身的ATG破坏掉。也可以说你的Cre利用了A基因的ATG。理论
上这样设计没有问题。
2）Cre只有Stop codon，没有pA，也没有问题。因为基因转录时候mRNA拼接，后面会有
A基因自己的pA。
3）这个设计当然表达Cre自己，不会表达融合蛋白。即使核糖体见到Stop codon没有掉下
来，可能因为不可知的原因滑到了下一个ATG，表达了另一个蛋白，对Cre自己来
讲，也是一个单一的蛋白。
4）理论上只要Cre有一点表达，即使比较弱，你的Reporter总是能够给你一些信号的。但
因为你说没有任何信号，所以说明Cre根本就没有表达。
但是什么原因不表达呢？我能想到的有4种可能行
A) Cre有突变。但可能性不大。相信不表达的话，你首先会想到测序。这个应该
被你排除了。
B) 启动子不全。做为BAC，这种可能性有（如果基因横跨上百kb,或几百kb)，但
比较小。建议做最后考虑。
C) 在BAC里有NeoR或类似抗性基因。做完重组之后应该去掉，而没有去掉。所以
破坏基因表达。不过我想你老板应该已经把它拿掉了。
D) 你给的信息太少。我不知道你基因在染色体上的结构。我有一种猜测，你的
基因的ATG在第一个外显子里，并且第一个外显子很短。接下来是一个比
较长的内含子。如果是这种结构的基因，Transcription factor complex（
涉及多种 transcription factors) 横跨Exon1。也就是说，transcription
factor binding sites 在exon1的前面和后面都有。你在Exon1里插入了一段
很长的DNA，完全破坏了转录因子们形成一个complex，所以不能启动表达。
如果是这种结构，我建议你把Cre放在后面的外显子里。比如，第2，3个外显子。
我自己半瓶水，只能抛砖引玉。相信有专家给你更好的解释。愿你好运。 |
H*********8
发帖数: 323 | 3 谢谢楼上的分析，真是非常透彻。ABC都排除了，看来只有D,我在几个星期前也就D的可
能性跟老板谈过，而且还举例说，我以前研究过的一个基因，在外显子2上有调控表达
的序列，一旦被突变，影响基因的表达。后来老板不大相信，没当回事。A基因第一个
外显子大概800BP,后面是个很长的第一内含子，老板突变掉A基因本身的ATG，在ATG后
大概20BP的地方插入CRE，但插入CRE的同时，删除了大概300BP的外显子1序列。我个人
怀疑删除的这300BP上有调控序列，或者楼上说的，转录因子结合位点。基因A是从第一
个外显子的ATG处开始翻译的，有选择性剪接，但在外显子3上。 |
l**********k
发帖数: 189 | 4 如果是这样的话，又多了一种可能性。在mRNA上，不是所有情况下第一个ATG
都是起始密码子。前后的序列，比如Kozak序列，才是决定mRNA从哪里开始翻
译的起始位点。我怀疑还有一种可能性，因为你们破坏了A本身的ATG，Cre放
在了20bp之后。有可能Cre自己的ATG不能作为kozak或类似序列，所以，不能
被核糖体视为一个ORF的start codon，所以不能表达你的Cre。再往后面的
ATG, 即使有可能被视做一个ORF的起始密码字，也会造成移码（66％可能性）
或表达不完全。算作第E种可能性吧。
最简单的办法就是，把Cre放在后面的外显子里，可以用2A或IRES表达一个完整
的Cre蛋白，如果你不喜欢融合蛋白的话。分析原因毕竟不是你自己的课题。
愿你好运。
【在 H*********8 的大作中提到】
: 谢谢楼上的分析，真是非常透彻。ABC都排除了，看来只有D,我在几个星期前也就D的可
: 能性跟老板谈过，而且还举例说，我以前研究过的一个基因，在外显子2上有调控表达
: 的序列，一旦被突变，影响基因的表达。后来老板不大相信，没当回事。A基因第一个
: 外显子大概800BP,后面是个很长的第一内含子，老板突变掉A基因本身的ATG，在ATG后
: 大概20BP的地方插入CRE，但插入CRE的同时，删除了大概300BP的外显子1序列。我个人
: 怀疑删除的这300BP上有调控序列，或者楼上说的，转录因子结合位点。基因A是从第一
: 个外显子的ATG处开始翻译的，有选择性剪接，但在外显子3上。
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H*********8
发帖数: 323 | 5 非常感谢！这个被突变的ATG是启始密码子，是翻译起始点，这个已经知道了。 另外并
不是所有的真核细胞的基因都需要Kozak序列吧？对这方面我了解的不多。
我用RT-PCR扩出了CRE mRNA 表达，说明转录没问题。我做了多次，发现有一次细胞颜
色转过来了，但只有不到1%的 细胞，问题是这个报告的基因有LEAKING,我们试了 很多
的报告基因都有LEAKING，所以即使颜色转换过来了，仍然不能说明CRE WORK了。跟对
照组比，确实要有更多的 细胞颜色转过来了。这次实验老板自己去显微镜看的，所以
他确信载体WORK了，但后来我 做了很多次，就是没有重复出来。所以我对那一次实验
持怀疑态度。因为显微镜下看，肉眼判读有误差。也许看起来是比对照组多，但也许是
细胞密度高带来的假相。
不知道怎么说服老板，我怕万一作出老鼠出来，根本不WORK，那不白费力气，时间吗. |
l**********k
发帖数: 189 | 6 从你的描述来看，你说能够检测到Cre mRNA（如果你的RT-PCR没有DNA的污染），
说明mRNA的转录没有问题（不知道是不是测的full-length)。如果是这样，说明没有
Cre 表达的确是蛋白翻译的问题。
不是所有的mRNA的ORF的ATG都有标准的Kozak结构，所以我说是Kozak或是类似
的结构能够让ATG做翻译起始密码子。有许多的基因的mRNA, 在其ORF的起始密码子
前面还会有一个或多个ATG，但它们并不是start codon。所以说核糖体结合mRNA后
遇到的第一个ATG并不一定是起始密码子。除了所谓的标准Kozak序列之外，肯定还
有其它机制让一个ATG成为起始密码子。这只不过是我自己的一点个人经验。十有八九
是错的。也希望别人能够回答。谢谢。
因为实在有点忙，所以可能不能及时回答您更多的问题了。抱歉。
【在 H*********8 的大作中提到】
: 非常感谢！这个被突变的ATG是启始密码子，是翻译起始点，这个已经知道了。 另外并
: 不是所有的真核细胞的基因都需要Kozak序列吧？对这方面我了解的不多。
: 我用RT-PCR扩出了CRE mRNA 表达，说明转录没问题。我做了多次，发现有一次细胞颜
: 色转过来了，但只有不到1%的 细胞，问题是这个报告的基因有LEAKING,我们试了 很多
: 的报告基因都有LEAKING，所以即使颜色转换过来了，仍然不能说明CRE WORK了。跟对
: 照组比，确实要有更多的 细胞颜色转过来了。这次实验老板自己去显微镜看的，所以
: 他确信载体WORK了，但后来我 做了很多次，就是没有重复出来。所以我对那一次实验
: 持怀疑态度。因为显微镜下看，肉眼判读有误差。也许看起来是比对照组多，但也许是
: 细胞密度高带来的假相。
: 不知道怎么说服老板，我怕万一作出老鼠出来，根本不WORK，那不白费力气，时间吗.
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