a*****i
发帖数: 679 | 1 说说心血管领域内常用的Cre小鼠：
Cardiac progenitor cells: Nkx2.5-Cre, Gata4-Cre
First heart field： Tbx5-Cre
Second heart filed: Isl1-Cre，Mef2c-Cre
心肌细胞（myocardium）：cTNT-Cre（胚胎发育早期即表达），alpha-MHC和Beta-MHC
（在成年小鼠中采用inducible诱导表达的比较多），Mlc2v（心室特异性），Mlc2a（
心房特异性），Tbx2-Cre（non-chamber myocardium，仅限于胚胎发育早期），SM22-
Cre或者smMHC-Cre（平滑肌特异性，但是经常有leaky到心肌细胞）。
心脏内膜（endocardium): Tie2-Cre(除了endocardium之外，在vascular endothelial
cell也有表达），Nfatc1-Cre（endocardium specific，参见2012年cell一篇文章）。
心脏外膜（epicardium）：Wt1-Cre，Tbx18-Cre
心脏传导系统... 阅读全帖 |
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l**********k
发帖数: 189 | 2 感谢zhaohu, daihsh, muhe1985, sunnyday, rayxixi, sumo2009, andycai,
lotkaeuler11, dua，以及Neverthink和直接写email或私信给我的朋友们的建议。我已
经把各位的建议拷贝下来，这周会把这批cre大鼠定下来然后尽快开始。
大鼠虽然不象小鼠目前用得这么广泛，但在神经疾病和心血管疾病方面的用途还是很大
的。而且目前能做大鼠基因敲进和cKO的地方很少，我想对我们来讲市场也远远超过我
们的产能了。之所以选择从cre大鼠开始做起，主要原因是如果有人想做cKO大鼠，一定
会需要cre大鼠。如果只是为单个客户做cre大鼠的定制化服务，其他客户要想用同样的
cre大鼠，我们就没有办法提供了。所以干脆先做一批常用cre大鼠。因为还没有见到任
何通过Knockin方法得到cre大鼠的报道，所以我想如果我们先做出一批来，说不定会把
模式大鼠的应用带起来。
神经方面有朋友给列出了10多个非常有用的cre大鼠，应该可以马上开始了。心血管方
面我们在综合一下各位的建议，希望也做一些。
lotkaeuler11 提到兔子和猴子，... 阅读全帖 |
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b*******0
发帖数: 48 | 3 实验室要做conditional knockout mice.从jackson lab 买了Cre mice line:
STOCK Tg(CAG-cre/Esr1*)5Amc/J. 我set up 了5个mating cage ,都是Cre hetero X
WT mice, 交了3个月。子代genotyping后，发现还有Cre transgene 的数目很少，一般
12个老鼠，只有2个带Cre. 比例才1:6,不是理论上后代应该有1：4含Cre 么？
请教各位，这个比例是正常的么，怎么提高子代Cre的数量阿？
多谢！ |
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l**********k
发帖数: 189 | 4 这是一个非常急需的大鼠。我们已经开始在大鼠上做rosa-loxP-STOP-loxP-XFP, 目的
是为了检测cre expression 特异性的。
不知道在小鼠研究中，神经和心血管领域哪种cre鼠最常用，这样我们在做cre大鼠的时
候，也有一个参考。因为想先做客户范围比较广，在科研领域最常用的，就象免疫研究
里的CD4-Cre, CD19-Cre, FoxP3-Cre, CD11c-Cre等。
谢谢。 |
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p***i
发帖数: 96 | 5 我用的是CAMKII Cre 老鼠与我的flox老鼠杂交，希望只在forbrain区knockdown我的
gene. 目前得到了Cre Hetero/flox hetero还有Cre homo/flox hetero.
请问如何检测knock down efficiency呢？
1. take forbrain, extract genome, RT PCR
2. perfuse brain, immunostain brain sections with antibody against my gene
of interest. Can I costain with anti Cre antibody? If so, where can I buy a
good one?
3. DAB staining brain sections using antibody against my gene of interest.
请问一般Cre 的knock down efficiency 是多高？ Cre homo or hetero 会有很大区别
吗？
谢谢 |
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t******k
发帖数: 599 | 6 我有一个line是cre-ert2 A／gfp reporter。现在需要cre－ert2 B／gfp reporter／
floxed gene。因为lab里已经没有gfp reporter老鼠，那我可以genotyping cre-ert2
A／gfp reporter，用cre-ert2 A negative／gfp reporter的老鼠去和cre－ert2 B／
floxed gene直接cross么？所有老鼠都是b6 background，那我还需要考虑cre-ert2 A
／gfp reporter会有background问题么？ |
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Z**********g
发帖数: 222 | 7 Transgenic cre为单或多拷贝,knock-in cre为单拷贝.不管是transgenic cre line还
是knock-in cre line,跟wt的后代只能是杂合子(heterozygote),而且试验中一般都用
heterozygote cre. |
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D*a
发帖数: 6830 | 8 cre刚切完还有蛋白也是可能的。flox/flox我觉得不影响cre的效率的，cre好用的话一
个两个都无所谓，不好用的话就是不好用了。
你做oocyte 的 genotype了么，是什么结果？直接上staining看蛋白了？当然oocyte
特异PCR不好做，但是你自己想办法看见带吧。
如果cre f/f的母老鼠跟+/- 公老鼠交配，后代应该是一半纯和致死的，你观察到了么？
你现在的信息说这个cre好用不好用都太早。 |
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s******e
发帖数: 370 | 9 看是什么promoter的cre
我碰上过一个EIIa－cre，发现用cre的公鼠经常出现partial KO，查了资料发现这个
promoter在oocyte里最活跃，受精后保持短暂活跃。于是换成cre的母鼠，效果就好多
了。 |
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h********n
发帖数: 4079 | 10 谢谢上面各位的意见.
我要用beta-actin-Cre mice, 准备用female Cre mice (homo) 和 LoxP geen A (homo
)杂交, 生下来的小老鼠挑出完全应该是 Cre+/- A+/-, 然后兄弟姐妹交配, 看A-/-的
胚胎发育的情况. 已知A-/-胚胎致死.
现在的问题是, 在比较A-/- 和 A +/+ 胚胎的时候, 我能不能把不同的Cre genotype合
并比较?
谢谢. |
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D*a
发帖数: 6830 | 11 不知道你说的partial KO是指什么，大多数时候用cre就是为了partial KO，这个
partial是specific的patial，比如只在特定器官，或者某种特定细胞中造成KO而不涉
及其他细胞，这样就避免了用total KO或者用全身+/-的老鼠，分析实验结果时不能确
定是整体影响，还是特定细胞的特定功能。
但有的partial KO是我们不希望的，比如利用脂肪细胞中的特定promotor建立了一个脂
肪细胞中表达的cre，然后每个器官分别摘出来验证时，发现在肝中也有KO，这就是cre
是leaky的，这个当初做老鼠时很难避免，因为你也不知道你的promotor是不是多用了
一块或者少用了一块，或者旁边一个调控元件根本就是未知的，再加上后面接的又是别
的蛋白，很难预测promotor的行为，比如到底在哪里表达，什么时候表达等等。这时候
paper发表前和发表后就很容易被人critique，不过也不是不能发到好杂志上，这个原
因就不分析了哈。。。但是结果其实有可能是leaky的那部分cre造成的，而跟你本来想
KO的那个器官没有关系。。。
我现在看的一篇nature文章，我 |
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s******e
发帖数: 370 | 12 我们做的是complete KO， 不是tissue specific，所以要从卵子开始就得有active的
cre——跟上面各位不同哈
F1出来，PCR，碰到过既有被cre切过以后产生的小带，又有未切的cKO带，就把这个叫
partial。究其原因，猜想可能是cre被transcribe出来的时间太晚又太短，受精卵分裂
之后有些细胞带了cre有些没有。
但是即使是partial，如果它的生殖细胞是KO，我们还是可以用它来establish line的。
tissue specific暂时还没有做到⋯⋯ |
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s******r
发帖数: 2876 | 13 哪一篇？说来学习学习。
不知道你说的partial KO是指什么，大多数时候用cre就是为了partial KO，这个
partial是specific的patial，比如只在特定器官，或者某种特定细胞中造成KO而不涉
及其他细胞，这样就避免了用total KO或者用全身+/-的老鼠，分析实验结果时不能确
定是整体影响，还是特定细胞的特定功能。
但有的partial KO是我们不希望的，比如利用脂肪细胞中的特定promotor建立了一个脂
肪细胞中表达的cre，然后每个器官分别摘出来验证时，发现在肝中也有KO，这就是cre
是leaky的，这个当初做老鼠时很难避免，因为你也不知道你的promotor是不是多用了
一块或者少用了一块，或者旁边一个调控元件根本就是未知的，再加上后面接的又是别
的蛋白，很难预测promotor的行为，比如到底在哪里表达，什么时候表达等等。这时候
paper发表前和发表后就很容易被人critique，不过也不是不能发到好杂志上，这个原
因就不分析了哈。。。但是结果其实有可能是leaky的那部分cre造成的，而跟你本来想
KO的那个器官没有关系。。。
我现在看 |
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h********n
发帖数: 4079 | 14 我以前一直做tissue specific的transgenic mice, 不是Cre.
现在用adeno-cre在肺里做肺癌/转移. 另外一个是beta-actin-Cre看看对老鼠胚胎发
育的影响, 这个应该是要完全KO.
cre |
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a*******g
发帖数: 162 | 15 我用的是从JACKSON买的，应该是NIH的那个。请问用ff tg和ff cre tg做control行吗
？还是你用+/+ cre tg; f/+ cre tg; f/f cre tg? 多谢！ |
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b*********g
发帖数: 65 | 16 因为老鼠数量现在不够，所以想用female A-Cre和male B flox/flox (A表示一种cre，
B表示要研究的gene) 来generate A-Cre+;B flox/flox的老鼠。
但是被告之，最好用male A-Cre和female B flox/flox这样的方式来交配，不然的话会
被flox site给delete掉，变成global deletion。
有谁能帮我解释一下原因吗？谢谢 |
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n*********m
发帖数: 38 | 17 This is because there is maternal effect for some Cre lines. I used Sox2-Cre
before. The offspring from female Sox2-Cre is indistinguishable from
conventional KO ones. But if your Cre line does not have this effect, it
should be OK, I think. |
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h********n
发帖数: 4079 | 18 我有个Cre-induced tissue specific KO mouse model.
在mammary gland里, 有些细胞会表达Cre, 可能是epithelial cell. 有什么比较方便
的办法可以知道有多少细胞表达了Cre然后完成KO?
IHC for Cre and the KO gene?
or in situ hybridization for the KO gene?
谢谢. |
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S******9
发帖数: 2837 | 19 是beta-actin的Cre？ 1084，1085，42，43 primers， Wt=300bp， Cre=100bp
才12只pups说明不了问题。
尤其是第一次生，总是litter size很小，后面就好一些。
你这个是inducible还是non-inducible的Cre? |
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z****u
发帖数: 1007 | 20 【 以下文字转载自 Neuroscience 讨论区 】
发信人: zhaohu (天外飞猪), 信区: Neuroscience
标 题: 用哪个cre 能特异knockout 某个gene 在periphery sensory nerv
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Apr 14 03:11:06 2012, 美东)
不是做神经的，最近发现某个颌面部的干细胞分布和peripheral sensory nerve fiber
紧密相关。想找个inducible cre来在sensory nerve fiber里knockout掉一些gene.
请教该用啥cre比较好啊。最好是inducible cre. 多谢先了。 |
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j****3
发帖数: 48 | 21 实验室有floxed的老鼠，打算注射Adnovirus给Cre recombinase...从一家公司买了一
个Ad-Cre,是有CMV promoter的，已经感染了HEK293细胞，收了细胞后（还没提纯），
现在想先看看病毒带的Cre序列有没有表达。跑了PCR可以看到带，但是WESTERN BLOT(
把HEK细胞裂解在RIPA buffer)用抗体却找不到Cre蛋白.咋回事呢？从没和病毒打过交
道，如果问的太傻，请尽量拍砖。。多谢 |
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b*****g
发帖数: 119 | 22 新人求教 我在做一个基因的oocyte specific KO 拿到正确genotype的老鼠后 去做
staining 那个蛋白居然还在... 请问会是些什么原因呢 我的mating scheme如下
Cre+ ; fl/+ male x fl/fl female 得到 Cre+ fl/fl female
现在想到的问题有一下几个 1.可能蛋白在Cre前就已经表达了
2. 同时excise 两个有loxP的allele是不是不够efficient阿? 由于我做的是oocyte 所
以尽量选择让公老鼠carry Cre, 因为是homozygous lethal 我不是不是需要一步一步
的去除基因呢
请问大家我该如何着手解决这个问题? 谢谢了! |
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h**********r
发帖数: 671 | 23 在给一个真菌做cre/lxop的knockout系统，想在一个质粒中装好cre和marker，两端是
loxp。cre克隆在真菌的诱导表达的启动子下游。cassette是这样子的：loxp-marker-
Promoter-cre-terminator-loxp。我是从AT克隆开始做的,pgem-t easy vector.问题是
最后一步怎么都装不上去。大小好像回到了最开始的pgem-t easy的载体上去了。初步
估计这个promoter在E. coli中也有表达，然后自己就把中间的那部分切下去了。试了
好几次，同样的情况。当然还没有sequence.请问大家遇到这种情况怎么办？ |
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n****3
发帖数: 543 | 24 我认为用cre作对照要好。许多文章已经发现cre对一些细胞有毒性，如果你的细胞对
cre敏感，建议用cre only做对照 |
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t******k
发帖数: 5617 | 25 We use HPRT-Cre for whole body KO
Some other strain also should be OK like:
ROSA26-Cre
ACTB-Cre
。。。。
If you want to avoid any possible mosaic expression, you should cross the
flox mice with cre mice to generate heterozytous F1. The deletion will also
happened on the sperm and egg of the F1 mice, then you can cross the +/-
mice with +/- mice to get the real global KO mice. |
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g***l
发帖数: 18555 | 26 有很多CRE的FINANCE明年2011年到期,好多都贬值了一半以上,据说很多中小银行要倒霉
,CRE的保险公司也面临巨亏,今天NPR上讲的,大家远离CRE和小银行了.有谁来分析分析. |
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h********n
发帖数: 4079 | 27 请教各位高人一个问题: conditional KO (LoxP) mice + Cre mice杂交产生KO mice
的时候,哪个是男/女有关系吗? 我好像有个印象, 应该要female Cre mice, 但不确定.
还有一个问题是, Cre对老鼠有其它影响吗?
哪位高人说说? 谢谢谢谢. |
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D*a
发帖数: 6830 | 28 没说反么? EIIa Cre 的母鼠才应该是total KO才对么？公的EIIa－cre后代是mosaic的
正在做这个。
ps 跟lz说，不光是EIIa Cre这种已知的造成后代mosaic的会这样，我现在用的一个
camk promoter 的公的，后代也时不时出来几只 total KO，所以一般新老鼠，你要把
脑心肝肾皮肤什么的都做一遍pcr，还有dynamic的KO时间，来确定它是不是specific
的，和KO时间是不是和你想要的一致。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 29 我们用的cre是postnatal的和组织specific的，所以卵子绝对不能有cre蛋白，如果有
就不是想要的KO了。
如果要从卵子就KO，可以直接用＋/- x ＋/- ,这样的话第一代随便找一个泛表达的
cre 就行了，公的母的都无所谓
也不知道lz要的是哪种，参考一下 |
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D*a
发帖数: 6830 | 30 你这种情况最好挑第一代的Cre -/- A+/-，
然后第二代用A+/- x A+/-，以后实验和保持老鼠line也通通是这样，这样比较的时
候没有父母的影响，而且你一次性有control A +/+， knockdown A+/- 和 KO A-/-
， 多出来的A+/- 正好用来生下一批。
F2 不要把cre带进去，带进去了说不定有cre插入位点的影响，这个你还没法证明，你
自己分析结果也不放心，以后reviewer也很可能揪住这个不放。
homo |
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s******e
发帖数: 370 | 31 还是那句话，看是什么cre
我用的cre是oocyte active，受精后短暂活跃，过了那个阶段就不表达了，所以精子里
来的cre有时就不够effective。beta-actin的话应该会好一点吧
其实我接触这个也才一年多，都是trouble shooting中攒的个人经验而已 |
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S******9
发帖数: 2837 | 32 你这个beta-actin Cre是non inducible的？
我们组研究的target基因就是在胚胎11.5～12.5天的时候死掉。即使是Tie2 Cre内皮特
异性的也是的。所以我们研究的成鼠是用的beta-actin Cre是inducible的，可惜我们
的flox做的不是特别好，有leaky现象，部分老鼠实际出生的时候已经有很大的ko了，
当然用药物诱导以后可以ko掉90%。
叫你老板把我招去吧，我喜欢做老鼠model的活。做atherosclerosis，vasoactivity，
原代血管内皮培养，各种组织切片染色。 |
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a*****g
发帖数: 543 | 33 MMTV-Cre is not perfect.
Try the newer one from Muller lab. MMTV-Cre-IRES-HER2; basically the Cre wi
ll be in the same cells as HER2; it should save you breeding time and give y
ou cleaner results.
He might got an inducible one as well. |
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D*a
发帖数: 6830 | 34 不知道有几个copy ，一般copy都是一个连一个，一起插到一个位点，cre老鼠都是
hemizygote的，子代是一半一半。
但是一般跟子代phenotype没关系啊，你的意思是cre多少能影响ko的多少？我见过文章
看cre的copy数和KO的关系的，你可以问作者。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 35 f/-是说flox/-? heterozygote？
其实我也不知道他的cre是怎么回事。。。
这个cre在老鼠里面不表达的么？表达的话不就是现成的conditional KO
anyway，既然有flox的老鼠，弄个+/- 还是挺容易的
有MeuCre40和EIIaCre，都可以造成杂合体胚胎，再交一代就是+/-了
不过现在conditional KO才是王道吧，+/-好像都没人玩了
好多cre也都商业化了吧 |
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Z**********g
发帖数: 222 | 36 一种可能是部分细胞被ko了,部分细胞没被ko,而你检测mRNA/蛋白/活性的时候,样品包
括了ko和没ko的细胞.另外一种情况是所有细胞只被ko了一个allele,另一个allele是wt
,也导致这种结果.所以要么该cre活性不够强,要么该cre在这群细胞中不均一表达.一个方
法是你可以把你的Cre;gene f/f的小鼠与GFP flox小鼠杂交,看看GFP的表达情况,同时
把GFP阳性的细胞FACS sorting出来,再检测mRNA/蛋白/活性. |
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m*p
发帖数: 226 | 37 同意楼上几位，在 heterozygous background, 引入cre， 这样，deletion
efficiency maybe higher. 也有可能，you have to introduce ROSA26YFP to
monitor that every Lsm-Cre cells has Cre activity. |
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A******d
发帖数: 571 | 38 应该是细胞compensatively upregulate at post-transcription level so that
protein is reduced less drastically
如果你用cre/-, try cre/cre to knock down more DNA
酶活性没有变化很奇怪，你是怎么测的？会不会有别的类似的酶被上调了？
败。 |
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m****r
发帖数: 383 | 39 把Ad-Cre打到mammary gland of a Cre reporter mouse,理论上会诱导gfp的表达，只
是不知道从注射，到cre-mediated recombination发生，直至gfp蛋白表达，这个
过程需要多久？一周？ |
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l****i
发帖数: 20439 | 40 一般不搞cre homo的。一个cre就足够了
efficiency要用cre;flox/flox的老鼠做
a |
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D*a
发帖数: 6830 | 41 1. take forbrain, extract genome, quantitative PCR
2 anti 目标蛋白 和 anti Cre antibody是我正想做的，见有paper做过，我们实验室
没有先例，尤其我们是膜蛋白更难搞。尤其是anti Cre antibody，版上用过的也告诉
我一声吧。
3 可以用cre杂交mice with reporter gene，比如lac z或者 某FP。 |
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p***i
发帖数: 96 | 42 但是我听说cre的recombination的效率最多只有60%， 请问是这样吗？如果是的话，那
么cre homo是否应该比册cre hetero更高效呢？
谢谢 |
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L***s
发帖数: 133 | 43 做了只转基因小鼠，lox-STOP-lox-gene-EGFP，EGFP是fuse在gene的C末端，target的
位置是ROSA26。
体外细胞试验很好, Cre转染后大量的GFP表达，功能也没问题，该基因不toxic。
好了，小鼠做好后，与Nestin-Cre line 杂交后，兴冲冲做了IHC (rabbit GFP Ab, invitrogen) ，结果很失望，发现GFP表达弱，且阳性细胞少；同样的Cre line 和ROSA26-YFP杂交后，同样的染色，YFP表达很强，阳性细胞很多。
帮忙分析一下原因
1. Fusion protein的问题？可能是fusion protein 表达量低？或是表达量可能并不那
么低，但在PFA fix时导致fusion protein被mask了，所以IHC看不到，证据是lox/lox
比lox/+的阳性细胞要多些。试了citrate buffer antigen retrieval (pH6, 95C,
15min)， 结果更差，一点阳性细胞也没有了。其他可行的antigen retrieval 方
法？
2. 因为target的位置... 阅读全帖 |
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a******p
发帖数: 414 | 44 一个可能是： 你的cre和loxp在同一条染色体上， 这种情况很难拿到 cre; loxp/loxp
. 可能得大规模的筛选， 规模取决于cre 和loxp的距离。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 45 it depends on the titre, infection efficiency, promoter and ur system etc..
generally speaking ad-cre can be more effective but with higher toxicity too
...I would go with lenti-cre if it is effective enough but for some stem
cells, it might not work well... |
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z****u
发帖数: 1007 | 46 我们以前是拿Wnt1-Cre. craniofacial的pericyte都是neural crest来的，所以被Wnt1
-Cre标记得很好. NG2-Cre我没有看过retina 的pericyte.但是至少在别的部位，标记
pericyte很好。 反正上个月开会，Philipe Soriano跟我说Ng2该是标记pericyte最好
的line了。今天NG2-CreERT刚到，才开始mating.
建议你换掉R26R reporter. LacZ 染色太麻烦了，强烈推荐ZsGreen reporter. 超级强
的荧光，PFA固定保存几个月都没问题。 |
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z****u
发帖数: 1007 | 47 Jeff Bush啊 我想标记效率肯定和部位有关。 在我检测的craniofacial region里面都
还不错。 不过确实应该拿多个line做比较，所以现在我们也在找别的line 包括PDGFrb
-Cre 还有Glast1-Cre
我们的NG2-Cre 以及CreERT都是Jax的。
ZsGreen是Allen Institue的Hongkui Zeng建立的，同时她还建立了另外很多个
reporter ，我用过的TdTomato, EYFP, ZsGreen都非常好。
Millipore的NG2 Ab我也在用，感觉不做antigen retrieval染的效果不太好。 |
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i*********0
发帖数: 915 | 48 最近我们这边的cre也是又问题，以前都是结合着actin （作为内参），cre和actin的
带都很sharp，现在不管怎么还条件都是smear。隐约能看到cre的带，但是actin基本上
看不到。 |
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D*a
发帖数: 6830 | 49 fl/+ 和 fl/fl的比例应该是没什么疑问，因为你这一步只是剪尾巴看体细胞。但是现
在你对oocyte敲除有疑问，让被敲除掉的卵子受精看看是不是能长成-/-，我觉得这个
应该比pool卵子更有效一些。
如果你用收获的卵细胞来做PCR或者RT PCR，如果混有别的细胞，会有污染，到时候你
也不知道是因为体细胞污染，还是因为你的卵细胞敲除不完全。
如果这个蛋白敲除不影响卵子受精和胚胎发育，-/-的老鼠我觉得是最有说服力的。
genytype的问题毕竟还是用genotype最有说服力。这是我能想到的方法了，不知道其他
人都是怎么做的。
PS我突然想到卵细胞是单倍体啊，按你写的母鼠genoytpe，你的Cre应该只能进一半的
细胞里啊，所以你的卵细胞不是应该只有一半是KO的？还是Cre相当多没有allele的卵
子里面也会有Cre蛋白？反而你的细胞里都是flox单倍体，没有两个等位基因需要敲除
啊，跟两个flox还是一个flox的效率没关系啊。 |
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f*******o
发帖数: 150 | 50 用cre之前要先测定你的蛋白表达谱， 看是否在很早期表达，如果5天左右表达量就很
高，用zp3恐怕就晚了。不过你用不同的cre可以得到不同的结果，这样你研究更全面，
发文章档次也会上去， 所以最好你两个都做，我看到有些人把zp3 cre, gdf9cre 甚至
cumulus cell里的基因都敲掉，然后放到一篇文章里。用b6 没有影响，在文章里表明
所用的种类即可。不同背景老鼠有时候，phenotype有些差别。
一般可以娶到280左右。 |
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