s******y
发帖数: 220 | 1 做immuno-precipitation, elution的步骤是直接把蛋白-抗体结合的beads放到gel
loading
buffer里面煮， 然后上样。
不能测量蛋白浓度的话，怎么掌控load的量呢？
我做了两个control，尽可能treat他们一样，可是差别貌似很大，请问能elute以后测
浓度再load
吗？
多谢啦！ |
s******s
发帖数: 13035 | 2 bind的蛋白不一样多，测了浓度就不对了
用用磁珠，可能你的control重复性会好一点。
【在 s******y 的大作中提到】
: 做immuno-precipitation, elution的步骤是直接把蛋白-抗体结合的beads放到gel
: loading
: buffer里面煮， 然后上样。
: 不能测量蛋白浓度的话，怎么掌控load的量呢？
: 我做了两个control，尽可能treat他们一样，可是差别貌似很大，请问能elute以后测
: 浓度再load
: 吗？
: 多谢啦！
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s******y
发帖数: 28562 | 3 这个很难做，属于我最讨厌的实验之一。最大的误差来源于洗resin的时候损失。
我一般是这么做的：
1. 把放抗体前的sample 调到同样体积， 然后取等量小样留下来分析 (S-0)
2.放抗体，blah blah blah 按照经典方法作。
3.放过量的resin。 可能的话混进等体积的blank sepharose bead 来增加体积。
4.把所有东西都装进mini-column 里面，等柱子成型后收集flow through.
然后把原来的管子用buffer 涮涮之后全部加到柱子上去以保证搜集到所有resin.
5. 洗柱子
6. Eluate：用1 volume 2XSDS-buffer (95oC) 洗脱，重复三次。
然后把柱子装到５０ml conical tube, spin down for 1 minutes, to collect all
the solution stuck in the resin bed.
【在 s******y 的大作中提到】
: 做immuno-precipitation, elution的步骤是直接把蛋白-抗体结合的beads放到gel
: loading
: buffer里面煮， 然后上样。
: 不能测量蛋白浓度的话，怎么掌控load的量呢？
: 我做了两个control，尽可能treat他们一样，可是差别貌似很大，请问能elute以后测
: 浓度再load
: 吗？
: 多谢啦！
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i******k
发帖数: 4625 | 4 mini-column是那个公司的？买过一些Pierce的，不太好用
【在 s******y 的大作中提到】
: 这个很难做，属于我最讨厌的实验之一。最大的误差来源于洗resin的时候损失。
: 我一般是这么做的：
: 1. 把放抗体前的sample 调到同样体积， 然后取等量小样留下来分析 (S-0)
: 2.放抗体，blah blah blah 按照经典方法作。
: 3.放过量的resin。 可能的话混进等体积的blank sepharose bead 来增加体积。
: 4.把所有东西都装进mini-column 里面，等柱子成型后收集flow through.
: 然后把原来的管子用buffer 涮涮之后全部加到柱子上去以保证搜集到所有resin.
: 5. 洗柱子
: 6. Eluate：用1 volume 2XSDS-buffer (95oC) 洗脱，重复三次。
: 然后把柱子装到５０ml conical tube, spin down for 1 minutes, to collect all
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s******y
发帖数: 28562 | 5 Bio-Rad Poly-Prep column
Cat# 731-1550
【在 i******k 的大作中提到】
: mini-column是那个公司的？买过一些Pierce的，不太好用
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i******k
发帖数: 4625 | 6 谢谢MM！
如果我的beads少于50uL，用这个column好操作么？
【在 s******y 的大作中提到】
: Bio-Rad Poly-Prep column
: Cat# 731-1550
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w**t
发帖数: 52 | 7 Input的量应该很好控制吧，一般的endorgenous protein而言total protein
concentration一样就好。IP的量就要看wash的过程有没有损失beads了，可以run1，
2ul看IP的量或IgG的量可以大概比较出该load多少。
至于艳阳MM的方法，不愧是做生化的高手，不过beads的量少的话也可以这么做么？而
且做得多的话（比如十多管IP），可能还是传统方法好handle吧。不过这种方式确实是
损失很小。 |
s******y
发帖数: 28562 | 8 50ul 勉强还可以，再小就不好操作了，
所以对于特别小的体积要加适量的blank sepharose beads.
【在 i******k 的大作中提到】
: 谢谢MM！
: 如果我的beads少于50uL，用这个column好操作么？
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s******y
发帖数: 28562 | 9 beads 量太小（少于50uL) 可以加适当的blank sepharose beads来填充体积。
管太多的时候就像你说的那样，挺麻烦的，特别是装那么多column很烦，特别
耗时间。不过装完之后就好了，可以把所有column 都装在那种Qiagen rack 上，
一起洗，其实还蛮方便的。我最多的时候同时做过8管。
另外，你指出这个是对的：在大部分情况下的确是可以用IgG 来做loading control。
用这个矫正体积后再跑胶。
我们实验室经常是做crosslinked IgG, 没有办法用这个loading control，
所以我一下子还真没有想到这一点。
【在 w**t 的大作中提到】
: Input的量应该很好控制吧，一般的endorgenous protein而言total protein
: concentration一样就好。IP的量就要看wash的过程有没有损失beads了，可以run1，
: 2ul看IP的量或IgG的量可以大概比较出该load多少。
: 至于艳阳MM的方法，不愧是做生化的高手，不过beads的量少的话也可以这么做么？而
: 且做得多的话（比如十多管IP），可能还是传统方法好handle吧。不过这种方式确实是
: 损失很小。
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j*****a
发帖数: 658 | 10 我觉得你IP， IB 你要检测的蛋白之后，同一张blot再看一下IP的那个蛋白就好了啊。
如果都一致的就无需担心啊。
另外我一般用20ul beads，貌似远远小于大家讨论的量。可我觉得20ul handle 1mg以
下的总蛋白足够了啊。当然这取决于你拉下来的那个蛋白量。我拉的是一个早期信号蛋
白，一种adaptor protein。可能不多。我觉得beads多很annoying，因为会带来非常大
的IgG band。当这个band非常强的的时候会类似屏蔽那种，影响周围方圆几百里的弱信
号。如果你分子量离50不远的话，我觉得70都很费劲。所以我情愿用少一点beads。 当
然如果做那种crosslink beads的就不存在这个问题了可能。我说的是经典ip。不知道
我的想法对不对，请教大家。谢谢。 |
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w**t
发帖数: 52 | 11 我们做IP的WB一般用anti-light chain or anti-heavy chain secondary antibody to
avoid IgG signal. |
m***i
发帖数: 898 | 12 wurt,
could you give more detail about how to avoid IgG signal? |
w**t
发帖数: 52 | 13 We are using the secondary antibody specifically recognizing the light chain
or heavy chain of primary IgG. Let's say our target protein is around 50kD,
we then choose the anti-light chain antibody which only recognize light
chain and show no signal at 50kD (heavy chain). Vice versa.
We buy it from Jackson ImmunoResearch. They have lots of different
antibodies. Such as the goat anti-mouse light chain:
http://www.jacksonimmuno.com/pdf/lots/93358.pdf |
s*****g
发帖数: 7857 | |
V***b
发帖数: 3419 | 15 To avoid IgG band during IP-western experiment, you can:
1. Run a non-reducing gel; the IgG H and L chain will not dissociate and
stay on the top of the gel as a tight and sharp band at ~200 kDa. Your
target protein will be clearly visible at 50 kDa.
2. Use mouse antibody for IP, and probe with rabbit antibody in Western. IgG
band would be very very weak, to the extent of not interfering your target
signal. |
g*********5
发帖数: 2533 | 16 1就不能用sds boil洗脱了吧。
IgG
target
【在 V***b 的大作中提到】
: To avoid IgG band during IP-western experiment, you can:
: 1. Run a non-reducing gel; the IgG H and L chain will not dissociate and
: stay on the top of the gel as a tight and sharp band at ~200 kDa. Your
: target protein will be clearly visible at 50 kDa.
: 2. Use mouse antibody for IP, and probe with rabbit antibody in Western. IgG
: band would be very very weak, to the extent of not interfering your target
: signal.
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V***b
发帖数: 3419 | 17 SDS sample bufffer boiling, with no DTT or b-ME.
【在 g*********5 的大作中提到】
: 1就不能用sds boil洗脱了吧。
:
: IgG
: target
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j*******8
发帖数: 933 | 18 2. Use mouse antibody for IP, and probe with rabbit antibody in Western.
IgG
target
就是说用不同源的二抗还是会检测到用来IP-的IgG? 为什么呢？
IgG
target |
s********d
发帖数: 156 | 19 这几天正准备做CO-IP/,也顺便请教一下大家。
如果对其中一个蛋白只有一种抗体AVAILABLE,可以IP IB用一样的，都是POLY.有人提议
用MAGNABIND GOAT ANTI-RIBBIT IgG beads(PIERCE)+Ab+CROSSLINKING. 然后LYSATES
也用磁珠PRECLEAR一下，然后一起O/N. 我要看的PROTEIN都在55KD左右。 大家看这
么做合理吗？ |
