g*******f
发帖数: 427 | 1 我最近在做一个蛋白的 SUMOylation, 用SUMO1(D-11)(SC5308,santa clus) 来IP,然后
用我要做的蛋白的抗体 blot,用的是 Dynabeads Protein G. 但是 没有任何 SUMOed
蛋白的带，但是比我的目标蛋白size 小的位置有一条很浓的带，我怀疑是从beads上
elute 下来的东西，会不会是IgG呢？
附图从左到右 lane 1－4： 不同处理的样品 用SUMO1 IP后用目标蛋白抗体blot; lane
5-8 是相应的 input; lane 9-12 是ip 后用 bead collect 后的 leftover。
从图上看IP 的样品在目标蛋白的位置没有任何带，但是下面很强的band 不知是什么？
不知是否是这个影响了 IP，如何消除掉这种非特异性。
还请对 SUMO 有经验的大小牛们不吝赐教。多谢 |
K****a
发帖数: 161 | 2 SUMO1 是mouse. 你的蛋白抗体是不是也是mouse？用的什么elution buffer?
lane
【在 g*******f 的大作中提到】
: 我最近在做一个蛋白的 SUMOylation, 用SUMO1(D-11)(SC5308,santa clus) 来IP,然后
: 用我要做的蛋白的抗体 blot,用的是 Dynabeads Protein G. 但是 没有任何 SUMOed
: 蛋白的带，但是比我的目标蛋白size 小的位置有一条很浓的带，我怀疑是从beads上
: elute 下来的东西，会不会是IgG呢？
: 附图从左到右 lane 1－4： 不同处理的样品 用SUMO1 IP后用目标蛋白抗体blot; lane
: 5-8 是相应的 input; lane 9-12 是ip 后用 bead collect 后的 leftover。
: 从图上看IP 的样品在目标蛋白的位置没有任何带，但是下面很强的band 不知是什么？
: 不知是否是这个影响了 IP，如何消除掉这种非特异性。
: 还请对 SUMO 有经验的大小牛们不吝赐教。多谢
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K****a
发帖数: 161 | 3 你要是担心抗体被elute，你可以把抗体和beads crosslink在一起
lane
【在 g*******f 的大作中提到】
: 我最近在做一个蛋白的 SUMOylation, 用SUMO1(D-11)(SC5308,santa clus) 来IP,然后
: 用我要做的蛋白的抗体 blot,用的是 Dynabeads Protein G. 但是 没有任何 SUMOed
: 蛋白的带，但是比我的目标蛋白size 小的位置有一条很浓的带，我怀疑是从beads上
: elute 下来的东西，会不会是IgG呢？
: 附图从左到右 lane 1－4： 不同处理的样品 用SUMO1 IP后用目标蛋白抗体blot; lane
: 5-8 是相应的 input; lane 9-12 是ip 后用 bead collect 后的 leftover。
: 从图上看IP 的样品在目标蛋白的位置没有任何带，但是下面很强的band 不知是什么？
: 不知是否是这个影响了 IP，如何消除掉这种非特异性。
: 还请对 SUMO 有经验的大小牛们不吝赐教。多谢
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g*******f
发帖数: 427 | 4 多谢回复，我用的蛋白抗体确实是mouse的，这样会有什么问题吗？
我没有 elute， 就是直接将loading buffer 加在洗过后的bead里，然后煮5min，就跑
western 了。 |
o**4
发帖数: 35028 | 5 25 kd跟 50 kd附近是会有很强的 IgG的信号的，
需要用true blot的二抗，
ebioscience有卖 |
e****s
发帖数: 1125 | 6 你的IP用的mouse,那么IB就最好不要用mouse。
特别你的目标蛋白要是~50或者25kd的话。
换个其他Species 的抗体。必要的话，甚至用light chain的二抗等其他办法来降低IgG
的干扰。
不过，貌似你这个没有SUMO被检测到。而且好像是用purified proteins做的，为什么
要做IP呢？不能直接用SUMO和目标蛋白的抗体跑WB来检测SUMO吗？
【在 g*******f 的大作中提到】
: 多谢回复，我用的蛋白抗体确实是mouse的，这样会有什么问题吗？
: 我没有 elute， 就是直接将loading buffer 加在洗过后的bead里，然后煮5min，就跑
: western 了。
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g*******f
发帖数: 427 | 7 多谢回复，我就是担心SUMO的蛋白比较少，所以先用SUMO1 IP 后再用我的目标蛋白抗
体blot。 请问您所说的直接用SUMO和目标蛋白的抗体跑WB来检测SUMO是怎么做呢？ 您
意思是用SUMO1 blot 然后 strip 再用目标蛋白的抗体跑WB吗？
IgG
【在 e****s 的大作中提到】
: 你的IP用的mouse,那么IB就最好不要用mouse。
: 特别你的目标蛋白要是~50或者25kd的话。
: 换个其他Species 的抗体。必要的话，甚至用light chain的二抗等其他办法来降低IgG
: 的干扰。
: 不过，貌似你这个没有SUMO被检测到。而且好像是用purified proteins做的，为什么
: 要做IP呢？不能直接用SUMO和目标蛋白的抗体跑WB来检测SUMO吗？
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g*******f
发帖数: 427 | 8 另外再请教一下，正常情况下我是指细胞没有激活的情况下细胞蛋白的SUMOylation 情
况是怎么样呢，我这个试验是用 FGF21处理细胞，suppose 这个蛋白的SUMO 是降低的
，从而激活下游基因，那么有没有一种试剂可以提高蛋白的SUMO 来做个对照？ |
b*******0
发帖数: 125 | 9 FGF21-----PPARg SUMOylation ? |
C**S
发帖数: 522 | 10 sumoylation挺难检测的。你的目的蛋白的sumoylation有没有被报道过？如果有文章发
表过，按照他的实验方法一模一样的重复，用的什么细胞系，哪个公司的抗体，体外还
是体内实验，先IP谁再WB谁，等等很多细节问题都要注意。 |
