b******3
发帖数: 377 | 1 核磁出来没多少峰，导师认为蛋白没有折叠，大肠表达，纯化什么的都没问题，怎么办
？谢谢！ |
m**z
发帖数: 787 | 2 NMR没有多少峰的原因很多吧，比如蛋白太大或者多聚,multiple conformational
state等等。。 反正我之前作的一个蛋白，肯定fold是没有问题的（nice alpha-
helical structure by CD and even crystal structure)，NMR出来就是没有几个峰。
我觉得不能用这个来推断没有folding.
相反，没有folding的蛋白据我理解应该有很多峰，只不过这些峰不disperse,全部集中
在HSQC中间的地方，这个好像是没有folding的一个特征。
CD应该是相对容易得看蛋白有没有folding得不错的方法
【在 b******3 的大作中提到】
: 核磁出来没多少峰，导师认为蛋白没有折叠，大肠表达，纯化什么的都没问题，怎么办
: ？谢谢！
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C*********m
发帖数: 213 | 3
15N HSQC 没有多少峰？那 一维氢谱的methyl区呢？
【在 b******3 的大作中提到】
: 核磁出来没多少峰，导师认为蛋白没有折叠，大肠表达，纯化什么的都没问题，怎么办
: ？谢谢！
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J********n
发帖数: 534 | 4 没错，看看1D的，就知道折叠没有了。
我们这里，小蛋白做结构前，通常都会扫一下1D，看看methy和aromatic区间有没有明
显的shift。
没有的话，有可能就是没折叠好，还有可能蛋白本身就是属于intrinsically
disordered。需要找到binding partner才能有稳定的结构。
【在 C*********m 的大作中提到】
:
: 15N HSQC 没有多少峰？那 一维氢谱的methyl区呢？
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b******3
发帖数: 377 | 5 楼上几位都太给力了，能不能给一些文献参考一下！这个19K的蛋白，还只是一个
domain，还是预测的序列，如果还是多聚，我就不用毕业了。
【在 m**z 的大作中提到】
: NMR没有多少峰的原因很多吧，比如蛋白太大或者多聚,multiple conformational
: state等等。。 反正我之前作的一个蛋白，肯定fold是没有问题的（nice alpha-
: helical structure by CD and even crystal structure)，NMR出来就是没有几个峰。
: 我觉得不能用这个来推断没有folding.
: 相反，没有folding的蛋白据我理解应该有很多峰，只不过这些峰不disperse,全部集中
: 在HSQC中间的地方，这个好像是没有folding的一个特征。
: CD应该是相对容易得看蛋白有没有folding得不错的方法
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p****s
发帖数: 3153 | 6 测测correlation time，也许知道是不是多聚了。我觉得是多聚的可能性比较大，就算
是没折叠的，也不会峰很少
要不做做H-C HMQC，不过估计比较贵，哈哈
【在 b******3 的大作中提到】
: 楼上几位都太给力了，能不能给一些文献参考一下！这个19K的蛋白，还只是一个
: domain，还是预测的序列，如果还是多聚，我就不用毕业了。
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m**z
发帖数: 787 | 7 你是必须要做结构吗？如果是对于一个新蛋白，做一些基本的biochemistry
characterization不可以吗？
【在 b******3 的大作中提到】
: 楼上几位都太给力了，能不能给一些文献参考一下！这个19K的蛋白，还只是一个
: domain，还是预测的序列，如果还是多聚，我就不用毕业了。
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s****7
发帖数: 176 | 8 貌似没这么简单吧
【在 m**z 的大作中提到】
: 你是必须要做结构吗？如果是对于一个新蛋白，做一些基本的biochemistry
: characterization不可以吗？
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b******3
发帖数: 377 | 9 就是做结构的。。。
CD谱蛋白浓度多少？1mg/mL行不？主要是盐浓度有50mM phosphate，有问题没？
【在 m**z 的大作中提到】
: 你是必须要做结构吗？如果是对于一个新蛋白，做一些基本的biochemistry
: characterization不可以吗？
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m**z
发帖数: 787 | 10 CD需要的蛋白量是很少的，一般~10 uM,就可以了，体积应该是400-500ul的样子，不同
的仪器和cuvette可能会不同。50 mM phosphate有一点高，另外NaCl也会影响。不过这
些影响主要都在far UV region (180-200nm).对于看二级结构的话应该影响不大
【在 b******3 的大作中提到】
: 就是做结构的。。。
: CD谱蛋白浓度多少？1mg/mL行不？主要是盐浓度有50mM phosphate，有问题没？
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s********n
发帖数: 2939 | 11 过一个简单的size exclusion就知道是否多聚了，没必要这么复杂吧？
【在 p****s 的大作中提到】
: 测测correlation time，也许知道是不是多聚了。我觉得是多聚的可能性比较大，就算
: 是没折叠的，也不会峰很少
: 要不做做H-C HMQC，不过估计比较贵，哈哈
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m**z
发帖数: 787 | 12 做结构的lab... NMR的确不一定每个蛋白都能做的。。。可以试试看不同的buffer条件
，包括pH,盐浓度等。我知道NMR对于这些条件的容忍度不是很高，不过还是可以一试。
还有就是你的HSQC是什么温度run的呢？如果只是25度的话，试试看提高温度到35甚至
40度，也许能有好一点的谱也不一定（当然你的蛋白要够稳定。。。）
我不是做结构的，不过我以前一个蛋白也试过NMR,那个时候晶体结构已经有了。25度的
时候也是只有几个peak,40度的时候好很多。后来发现蛋白会形成tetramer.可能提高温
度有利于某一种state,所以能看到不少峰。我们认为应该就是这个tetramer...这样的
话就是一个45kDa的分子。后来有人还试过full deuteration.谱又好了很多，不过还是
不ideal...现在不知道还有没有人再努力。。。所以我觉得有时候NMR条件的优化是得
益于你对这个蛋白性质的了解得。
或者能不能同时也试试看crystal呢？也许能多一点机会。
【在 b******3 的大作中提到】
: 就是做结构的。。。
: CD谱蛋白浓度多少？1mg/mL行不？主要是盐浓度有50mM phosphate，有问题没？
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s********n
发帖数: 2939 | 13 外行请问NMR能够在高温下做么？比如60-100 degree C.
【在 m**z 的大作中提到】
: 做结构的lab... NMR的确不一定每个蛋白都能做的。。。可以试试看不同的buffer条件
: ，包括pH,盐浓度等。我知道NMR对于这些条件的容忍度不是很高，不过还是可以一试。
: 还有就是你的HSQC是什么温度run的呢？如果只是25度的话，试试看提高温度到35甚至
: 40度，也许能有好一点的谱也不一定（当然你的蛋白要够稳定。。。）
: 我不是做结构的，不过我以前一个蛋白也试过NMR,那个时候晶体结构已经有了。25度的
: 时候也是只有几个peak,40度的时候好很多。后来发现蛋白会形成tetramer.可能提高温
: 度有利于某一种state,所以能看到不少峰。我们认为应该就是这个tetramer...这样的
: 话就是一个45kDa的分子。后来有人还试过full deuteration.谱又好了很多，不过还是
: 不ideal...现在不知道还有没有人再努力。。。所以我觉得有时候NMR条件的优化是得
: 益于你对这个蛋白性质的了解得。
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b******3
发帖数: 377 | 14 我们老板的意思是基本上提出来不折叠就不折叠了，废那个劲换buffer，调温度，不如
直接换个sequence再试。唉，再撞撞运气吧。多谢了。
【在 m**z 的大作中提到】
: 做结构的lab... NMR的确不一定每个蛋白都能做的。。。可以试试看不同的buffer条件
: ，包括pH,盐浓度等。我知道NMR对于这些条件的容忍度不是很高，不过还是可以一试。
: 还有就是你的HSQC是什么温度run的呢？如果只是25度的话，试试看提高温度到35甚至
: 40度，也许能有好一点的谱也不一定（当然你的蛋白要够稳定。。。）
: 我不是做结构的，不过我以前一个蛋白也试过NMR,那个时候晶体结构已经有了。25度的
: 时候也是只有几个peak,40度的时候好很多。后来发现蛋白会形成tetramer.可能提高温
: 度有利于某一种state,所以能看到不少峰。我们认为应该就是这个tetramer...这样的
: 话就是一个45kDa的分子。后来有人还试过full deuteration.谱又好了很多，不过还是
: 不ideal...现在不知道还有没有人再努力。。。所以我觉得有时候NMR条件的优化是得
: 益于你对这个蛋白性质的了解得。
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m**z
发帖数: 787 | 15 那么高倒是没有听说过... 蛋白的话那么高温度能稳定不沉淀嘛。。
【在 s********n 的大作中提到】
: 外行请问NMR能够在高温下做么？比如60-100 degree C.
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p****s
发帖数: 3153 | 16 我见过有70度条件下做的，但是取决于蛋白。如果蛋白在那个温度下要变性自然就不行了
【在 s********n 的大作中提到】
: 外行请问NMR能够在高温下做么？比如60-100 degree C.
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p****s
发帖数: 3153 | 17 提高温度是提高分子tumbling的速度，减小correlation time，延长弛豫时间，嗯
可能还是分子量太大了，25k以上似乎就要用一些特殊手段来做
【在 m**z 的大作中提到】
: 做结构的lab... NMR的确不一定每个蛋白都能做的。。。可以试试看不同的buffer条件
: ，包括pH,盐浓度等。我知道NMR对于这些条件的容忍度不是很高，不过还是可以一试。
: 还有就是你的HSQC是什么温度run的呢？如果只是25度的话，试试看提高温度到35甚至
: 40度，也许能有好一点的谱也不一定（当然你的蛋白要够稳定。。。）
: 我不是做结构的，不过我以前一个蛋白也试过NMR,那个时候晶体结构已经有了。25度的
: 时候也是只有几个peak,40度的时候好很多。后来发现蛋白会形成tetramer.可能提高温
: 度有利于某一种state,所以能看到不少峰。我们认为应该就是这个tetramer...这样的
: 话就是一个45kDa的分子。后来有人还试过full deuteration.谱又好了很多，不过还是
: 不ideal...现在不知道还有没有人再努力。。。所以我觉得有时候NMR条件的优化是得
: 益于你对这个蛋白性质的了解得。
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o****e
发帖数: 1011 | 18 楼主做CD怕信号小的话，可以用path length大些的cuvette。
（不过需要的volume也要相对多一点儿）
【在 m**z 的大作中提到】
: CD需要的蛋白量是很少的，一般~10 uM,就可以了，体积应该是400-500ul的样子，不同
: 的仪器和cuvette可能会不同。50 mM phosphate有一点高，另外NaCl也会影响。不过这
: 些影响主要都在far UV region (180-200nm).对于看二级结构的话应该影响不大
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s********n
发帖数: 2939 | 19 我有一个热稳定的蛋白，Tm>90C，在70和90C有一些不同的特性，通过MD simulation发
现蛋白结构的一些区域在不同温度下有一些有意思的现象，比如说有几个区域在90度
RMSF比在70C下大很多（这很正常），但有一个区域70C比90C大很多，这个现象可能可
以和这个蛋白在这两个温度下的不同特性相联系。
现在就是除了做mutation外，能否用一些生物物理的方法来检测。CD是可以检测整个蛋
白的构象变化，但好像不能检测到区域。所以想问问NMR能否在高温下做？现在能够做
到多大蛋白（我的蛋白大概35 kda）？NMR能否检测到蛋白结构中不同区域的变化？
行了
【在 p****s 的大作中提到】
: 我见过有70度条件下做的，但是取决于蛋白。如果蛋白在那个温度下要变性自然就不行了
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p****s
发帖数: 3153 | 20 我觉得大小不成问题...但是能做那么高温度的NMR仪器估计不好找，问问你所在学校吧
70-90C的条件下，蛋白转得很快了吧，35kd应该很合适。NMR可以做很高分辨的东西，
比如CPMG可以做每个残基的动
力学变化。我觉得关键还是有没有能做这么高温度的仪器。
【在 s********n 的大作中提到】
: 我有一个热稳定的蛋白，Tm>90C，在70和90C有一些不同的特性，通过MD simulation发
: 现蛋白结构的一些区域在不同温度下有一些有意思的现象，比如说有几个区域在90度
: RMSF比在70C下大很多（这很正常），但有一个区域70C比90C大很多，这个现象可能可
: 以和这个蛋白在这两个温度下的不同特性相联系。
: 现在就是除了做mutation外，能否用一些生物物理的方法来检测。CD是可以检测整个蛋
: 白的构象变化，但好像不能检测到区域。所以想问问NMR能否在高温下做？现在能够做
: 到多大蛋白（我的蛋白大概35 kda）？NMR能否检测到蛋白结构中不同区域的变化？
:
: 行了
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m**z
发帖数: 787 | 21 re 这个。只要有合适的NMR,纯化一些N15-label的蛋白，试试看，也许就能知道有没有
希望work了。这个从时间和钱上面来讲都不算需要花费很多。
【在 p****s 的大作中提到】
: 我觉得大小不成问题...但是能做那么高温度的NMR仪器估计不好找，问问你所在学校吧
: 70-90C的条件下，蛋白转得很快了吧，35kd应该很合适。NMR可以做很高分辨的东西，
: 比如CPMG可以做每个残基的动
: 力学变化。我觉得关键还是有没有能做这么高温度的仪器。
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C*********m
发帖数: 213 | 22 到了70度，amide proton的交换非常快，用15N标记估计也看不到什么东西。
【在 m**z 的大作中提到】
: re 这个。只要有合适的NMR,纯化一些N15-label的蛋白，试试看，也许就能知道有没有
: 希望work了。这个从时间和钱上面来讲都不算需要花费很多。
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s********n
发帖数: 2939 | 23 像这种情况表达的蛋白需要C13和N15都标记吗？ |
s********n
发帖数: 2939 | 24 这个是什么意思？NMR不是检测H1, N15和C13么？
【在 C*********m 的大作中提到】
: 到了70度，amide proton的交换非常快，用15N标记估计也看不到什么东西。
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p****s
发帖数: 3153 | 25 好像也可以做的，不一定会被交换掉。对于常用的HSQC来说，是从H开始到N然后再到H，靠的是J-
coupling，而一开始的信号来自amide上的H，amide上的H可以和水交换。如果交换速度
太快，这个H就观测不到了。不过看起来如果有氢键（二级结构）存在的话，交换速度会慢很多。别
的常用的3D NMR方法都是建立在HSQC的基础上。你可以看看下面的文章，一个49kD的蛋白（寡聚），
在80C条件下做的。
http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/ja1064608
【在 s********n 的大作中提到】
: 这个是什么意思？NMR不是检测H1, N15和C13么？
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p****s
发帖数: 3153 | 26 如果没有以前的assignments必须用C13，否则没法进行assignment。说不定还要用D
【在 s********n 的大作中提到】
: 像这种情况表达的蛋白需要C13和N15都标记吗？
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s********n
发帖数: 2939 | 27 我大概查了一下，Brown U好像可以做到-150 to 160 C，还有其他几个Universities也
可以做。
有几个问题想请教一下：
1. 文章提到他们的蛋白用N15, C13 label，有的用D2/C13 label，这是两个实验么？
还是说这个蛋白需要用三种标记？
2. 用D2/C13 label的蛋白在纯化过程中用的是普通的水还是D2O?
3. N15/C13 label的蛋白纯化需要用特殊的试剂么？比如说是否需要杜绝带有N14/C12
的试剂？
4. 整个过程如果顺利的话需要多少时间？我在考虑是否值得花这么大的力气去做。
H，靠的是J-
度会慢很多。别
蛋白（寡聚），
【在 p****s 的大作中提到】
: 好像也可以做的，不一定会被交换掉。对于常用的HSQC来说，是从H开始到N然后再到H，靠的是J-
: coupling，而一开始的信号来自amide上的H，amide上的H可以和水交换。如果交换速度
: 太快，这个H就观测不到了。不过看起来如果有氢键（二级结构）存在的话，交换速度会慢很多。别
: 的常用的3D NMR方法都是建立在HSQC的基础上。你可以看看下面的文章，一个49kD的蛋白（寡聚），
: 在80C条件下做的。
: http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/ja1064608
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m**z
发帖数: 787 | 28 here are what i know:
1. D2 label是对于比较大的蛋白质比较有用的方法。我觉得第一步通常只是N15标记，
这个便宜。然后根据得到的结果考虑要不要继续以及如何继续。要做assignment,N15/
C13-label是必须的。D2 根据需要把
2&3.no special reagen required during purification, otherwise it will be way
too expensive.
4.纯化过程并无区别，蛋白的表达可能需要优化。如果你的蛋白在LB表达很好的话，应
该不用担心。当然D2 标记的话可能还要考虑e.coli的grow.具体要参考文献。我只做过
N15label，其他的都是实验室其他人做的。我也不清楚如果一切顺利的话，从开始到
assignment到得到你需要的数据需要多久。。。
C12
【在 s********n 的大作中提到】
: 我大概查了一下，Brown U好像可以做到-150 to 160 C，还有其他几个Universities也
: 可以做。
: 有几个问题想请教一下：
: 1. 文章提到他们的蛋白用N15, C13 label，有的用D2/C13 label，这是两个实验么？
: 还是说这个蛋白需要用三种标记？
: 2. 用D2/C13 label的蛋白在纯化过程中用的是普通的水还是D2O?
: 3. N15/C13 label的蛋白纯化需要用特殊的试剂么？比如说是否需要杜绝带有N14/C12
: 的试剂？
: 4. 整个过程如果顺利的话需要多少时间？我在考虑是否值得花这么大的力气去做。
:
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p****s
发帖数: 3153 | 29 1. 没看文章不清楚，我觉得应该是大部分样品都是D,13C和15N标记
2. 纯化过程是用普通水，表达过程中用重水
3. 不需要，都是蛋白呀，C和N在蛋白里是稳定的原子，不会和别的发生交换。amide H
(D)和OH的
H(D)可以与水中的H交换，这也是D代蛋白里HSQC的H信号的来源
4. 不知道需要多少时间，取决于你的谱的质量，你可以先用D和15N标记看看HSQC的谱
怎么样。或者不
用D先看看。如果峰特窄的话就有往下面做的意义，不过我觉得基本没什么问题。其实
我没做过
solution NMR解谱...一般的蛋白从得到谱算一个月怎么样都能解出来了。不过你的蛋
白太大，我估
计可能要用一些4D的方法吧。
C12
【在 s********n 的大作中提到】
: 我大概查了一下，Brown U好像可以做到-150 to 160 C，还有其他几个Universities也
: 可以做。
: 有几个问题想请教一下：
: 1. 文章提到他们的蛋白用N15, C13 label，有的用D2/C13 label，这是两个实验么？
: 还是说这个蛋白需要用三种标记？
: 2. 用D2/C13 label的蛋白在纯化过程中用的是普通的水还是D2O?
: 3. N15/C13 label的蛋白纯化需要用特殊的试剂么？比如说是否需要杜绝带有N14/C12
: 的试剂？
: 4. 整个过程如果顺利的话需要多少时间？我在考虑是否值得花这么大的力气去做。
:
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p****s
发帖数: 3153 | 30 我建议你找一个NMR合作者，这点东西如果不是专门做NMR的不会投入很大精力。做出来
你们都有
credit,做不出来你也不亏什么。
你可以做做别的生化和生物物理，比如CD，热变性什么的。如果想得到残基尺度的动力
学信息，做NMR
是最好了。（其实别的生物物理方法我也不是懂太多...）
C12
【在 s********n 的大作中提到】
: 我大概查了一下，Brown U好像可以做到-150 to 160 C，还有其他几个Universities也
: 可以做。
: 有几个问题想请教一下：
: 1. 文章提到他们的蛋白用N15, C13 label，有的用D2/C13 label，这是两个实验么？
: 还是说这个蛋白需要用三种标记？
: 2. 用D2/C13 label的蛋白在纯化过程中用的是普通的水还是D2O?
: 3. N15/C13 label的蛋白纯化需要用特殊的试剂么？比如说是否需要杜绝带有N14/C12
: 的试剂？
: 4. 整个过程如果顺利的话需要多少时间？我在考虑是否值得花这么大的力气去做。
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m**z
发帖数: 787 | 31 同意。都自己来的话，就算谱图都好，那些软件什么的都得捉摸挺长时间。那些东西都
学会，在作出需要的结果，都快大半个PhD了。。。
【在 p****s 的大作中提到】
: 我建议你找一个NMR合作者，这点东西如果不是专门做NMR的不会投入很大精力。做出来
: 你们都有
: credit,做不出来你也不亏什么。
: 你可以做做别的生化和生物物理，比如CD，热变性什么的。如果想得到残基尺度的动力
: 学信息，做NMR
: 是最好了。（其实别的生物物理方法我也不是懂太多...）
:
: C12
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m**z
发帖数: 787 | 32 H-D exchange mass-spec is another way for dynamics study.
【在 p****s 的大作中提到】
: 我建议你找一个NMR合作者，这点东西如果不是专门做NMR的不会投入很大精力。做出来
: 你们都有
: credit,做不出来你也不亏什么。
: 你可以做做别的生化和生物物理，比如CD，热变性什么的。如果想得到残基尺度的动力
: 学信息，做NMR
: 是最好了。（其实别的生物物理方法我也不是懂太多...）
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: C12
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p****s
发帖数: 3153 | 33 也可以用HX NMR，哈哈
总觉得mass spec分辨率不太好，嗯，当然跟NMR好像是互补的
【在 m**z 的大作中提到】
: H-D exchange mass-spec is another way for dynamics study.
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m**z
发帖数: 787 | 34 那是啊，这不是在寻找alternative method嘛。。。：）
【在 p****s 的大作中提到】
: 也可以用HX NMR，哈哈
: 总觉得mass spec分辨率不太好，嗯，当然跟NMR好像是互补的
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s********n
发帖数: 2939 | 35 Thank mmzz and prales!
我就不一一回复了，你们的回帖解决了我的大部分疑问，如果我决定做的话肯定是找合
作者的，我也就了解一下原理和背景就行了。我也想用其他的生物物理的方法，但就我
所知好像没有其他特别合适的（H-D exchange mass-spec能够检测到residue么？）。
我的蛋白表达量挺高的，纯化也很简单（一步），希望在我可控的范围内不会有太大的
问题。呵呵！ |
m**z
发帖数: 787 | 36 H-D exchange mass-spec是可以做到residue specific的，但不能cover整个蛋白，
coverage可能在70-80%就不错了，分辨率和coverage取决于蛋白非特异性酶切后产生的
片断的overlap.
【在 s********n 的大作中提到】
: Thank mmzz and prales!
: 我就不一一回复了，你们的回帖解决了我的大部分疑问，如果我决定做的话肯定是找合
: 作者的，我也就了解一下原理和背景就行了。我也想用其他的生物物理的方法，但就我
: 所知好像没有其他特别合适的（H-D exchange mass-spec能够检测到residue么？）。
: 我的蛋白表达量挺高的，纯化也很简单（一步），希望在我可控的范围内不会有太大的
: 问题。呵呵！
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s********n
发帖数: 2939 | 37 I really appreciate your help!
【在 m**z 的大作中提到】
: H-D exchange mass-spec是可以做到residue specific的，但不能cover整个蛋白，
: coverage可能在70-80%就不错了，分辨率和coverage取决于蛋白非特异性酶切后产生的
: 片断的overlap.
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